豆科植物最显著的特点是能够与根瘤菌之间建立互惠共生的关系,豆科植物与根瘤菌共生互作诱导根瘤器官形成。生活在根瘤中的根瘤菌可以将氮气转化为能被植物吸收利用的氨,同时豆科植物为根瘤菌提供生长繁殖所需要的碳源营养。豆科植物形成固氮根瘤需要经过多个步骤,在豆科植物与根瘤菌之间存在着复杂的信号通路。过去的大量研究表明,活性氧（ROS）作为一个重要的信号分子参与植物的生长和发育、植物抗逆和植物—微生物的互作过程。植物呼吸爆发氧化酶Rboh是产生ROS的主要来源,在豆科植物及非豆科植物中都包含有数个Rboh基因。为了解析ROS在共生固氮中的作用机制,我们研究了百脉根中3个编码Rboh的基因,分别命名为RbohA,RbohB和RbohC。通过分析豆科植物中Rboh系统进化树及对比分析百脉根中各Rboh基因的表达图谱,发现百脉根中LjRbohA（Lj5g3v1497840）在根瘤中特异表达,LjRbohB（Lj6g3v1549190）和LjRbohC（Lj5g3v1497820）在根瘤中高表达。我们推测RbohA、RbohB和RbohC可能在共生固氮中发挥重要作用,并围绕上述3个基因展开了以下研究:1.分别构建了LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC蛋白烟草亚细胞定位的载体,利用农杆菌介导烟草叶片瞬时表达蛋白,于激光共聚焦显微镜下观察蛋白定位情况。结果表明LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC都定位在植物的细胞膜上。2.通过qRT-PCR反应检测百脉根接种根瘤菌后不同时期的根部组织LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC基因的表达水平,结果表明,百脉根根瘤中特异表达的基因LjRbohA在接种根瘤菌后表达上调非常显著,而LjRbohB在接种根瘤菌1d后有短暂上调表达,LjRbohC在接种根瘤菌后表达也上调了5倍,但没有LjRbohA显著。3.LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC基因的启动子活性分析:分别构建了LjRbohA和LjRbohB基因启动子与GUS报告基因的融合载体。利用农杆菌介导的毛根转化体系获得转基因植株,然后在百脉根的根和根瘤中检测GUS活性。结果表明,LjRobh A和LjRobh B基因在根瘤、维管束和侧根原基表达。4.利用本实验室改造的CRISPR-Cas9系统,成功构建了适用于百脉根毛根转化的载体,该载体利用CIRSPR技术同时对3个基因进行敲除,每个基因设计了4个g RNA,进行多靶点编辑。利用CRISPR-Cas9技术分别对LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC基因进行了单敲、双敲及三敲,观察共生结瘤表型:首先对LjRboh基因家族的基因LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC进行三敲后,毛根转化转基因植株结瘤数目减少。为了进一步研究这3个基因各自对百脉根结瘤过程的影响,分别对这3个基因进行了单敲和双敲。结果发现,对百脉根根瘤中特异性表达基因LjRbohB进行单基因敲除时结瘤数目减少。同时,对LjRbohA和LjRbohC进行双基因同时敲除时结瘤数目也比对照组减少。以上研究结果表明:LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC 3个基因可能都参与调控了百脉根与根瘤菌的共生结瘤过程,为进一步理解活性氧在调控共生固氮中的作用机理提供理论依据。