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目的： 1.证实HCMV感染THP-1源性巨噬细胞后可被AIM2识别，诱导AIM2炎性体活化； 2.应用siRNA干扰技术，研究HCMV感染THP-1源性巨噬细胞所致炎性体相关分子事件，以明确HCMV诱导的炎性体活化是否依赖AIM2蛋白； 3.探索HCMV被膜蛋白pUL83与AIM2蛋白之间的相互作用； 4.明确pUL83-AIM2相互作用对AIM2炎性体通路的影响。 方法： 一、HCMV感染THP-1源性巨噬细胞诱导AIM2炎性体活化 1. PMA(100 ng/ml)刺激培养THP-1细胞24 h获得THP-1源性巨噬细胞； 2. HCMV AD169毒株感染 THP-1源性巨噬细胞（MOI=1)后1h、3h、6h、12h、24 h、48 h和96 h收集细胞培养上清，同时设立模拟感染对照组；poly(dA:dT)(1g/ml)转染THP-1源性巨噬细胞24 h作为阳性对照组； 3.取各时间点培养上清，应用ELISA检测细胞因子IL-1p和IL-18浓度以评估AIM2炎性体活化状态；应用LDH检测试剂盒检测LDH含量以评估细胞死亡情况； 4.收集感染后1h、6h、24h各组细胞，提取总蛋白，应用免疫共沉淀实验检测HCMV感染后AIM2与ASC蛋白的结合。 二、AIM2基因沉默对HCMV诱导的炎性体活化和病毒基因转录的影响 1.应用AIM2特异性siRNA转染THP-1源性巨噬细胞72 h，得到AIM2沉默的巨噬细胞（S+)，同时用无关siRNA(Stealth negative control L O G C)转染THP-1源性巨噬细胞，得到模拟沉默对照细胞（S-); HCMV AD169毒株分别感染S+和 S-(MOI=1)，即S+/V+和 S-/V+，同时设立模拟感染对照组，即S+/V-和S-/V-; 2.感染/模拟感染1 h、6 h、24 h后收集四组细胞总蛋白，采用Western-blot检测AIM2、pro-caspase-1、p10(活化caspase-1片段）、pro-IL-ip和IL-1p的蛋白表达水平； 3.感染1 h、3 h、6 h、12 h和24 h后收集V+组细胞培养上清，应用ELISA检测细胞因子IL-ip和IL-18浓度；应用L D H检测试剂盒检测L D H含量； 三、HCMV被膜蛋白pUL83与人AIM2蛋白的相互作用 1.登陆NCBI GenBank网站，查询HCMV AD169毒株UL83基因序列和人源AIM2基因序列，设计合成扩增全序列的特异性引物以扩增两个目的基因； 2.应用In-fusion技术将目的基因UL83和AIM2分别插入到p M载体和pVP16载体中，得到pM-UL83和pVP-AIM2重组表达载体，理论上可分别表达D N A BD-pUL83和AD-AIM2重组蛋白； 3.应用钙转染法将pM-UL83和pVP-AIM2转染到HEK293T细胞中，72 h后收集细胞提取总蛋白，应用Western-blot技术检测两个重组表达载体的表达情况； 4.应用钙转染法将pM-UL83、pVP-AIM2和分泌型碱性磷酸酶（SEAP)报告基因一同转染到HEK293T细胞中，72 h后收集细胞培养上清和细胞，应用化学发光法检测上清中SEAP浓度；提取细胞蛋白应用免疫共沉淀法检测两重组蛋白的结合； 四、pUL83与AIM2蛋白结合对AIM2炎性体通路的影响 1.登陆NCBIGen Bank网站，查询人源ASC、 caspase-1和IL-ip基因，设计合成全序列特异性引物以扩增目的基因。应用In-fusion技术将ASC、caspase-1和IL-ip基因（保留终止密码子）分别插入到pDsRed-N1载体中，理论上，三个重组载体分别表达ASC、pro-caspase-1和pro-IL-ip蛋白； 2.将pVP-AM2和ASC、caspase-：l和IL-ip重组表达载体共转染至HEK293T细胞中，命名为rHEK293T细胞，72 h后应用Western-blot检测AIM2、ASC、pro-caspase-1和pro-IL-ip蛋白的表达； 3. poly(dA:dT)转染rHEK293T6 h和24 h后提取细胞总蛋白；p M-U L83重组表达载体转染rHEK293 T细胞后转染poly(dA:dT)6 h和24 h后提取细胞总蛋白。Western-blot检测 AIM2、ASC、pro-caspase-1、p10、pro-IL-ip和IL-ip的蛋白水平； 4. ASC、caspase-1和 IL-ip重组表达载体共转染至H E K293 T细胞中，命名为rHEK293T( AIM2-)细胞，重复方法3中的实验。 结果： 一、HCMV感染THP-1源性巨噬细胞诱导AIM2炎性体活化 1. HCMV感染THP-1源性巨噬细胞后，IL-1p和 IL-18释放量随着感染时间的推移而增加，前者自感染后12 h起明显高于感染前水平，后者在感染48 h后明显高于感染前水平，差异有统计学意义；感染组LDH含量在感染后3h，48h和96h时较模拟感染组增高，差异有统计学意义； 2.在HCMV感染THP-1源性巨噬细胞后1?24h期间，AIM2与ASC蛋白相结合。 二、AIM2基因沉默抑制HCMV诱导的炎性体活化和病毒基因转录 1. AIM2蛋白：S-细胞感染HCMV后6h，AIM2蛋白含量较感染前明显升高，感染后24 h下降；S+细胞中几乎无AIM2蛋白表达； 2. caspase-1前体与活化片段p10: pro-caspase-1在各组细胞中较稳定表达；V-组细胞无p10表达；S-细胞在感染HCMV后1h可检测到少量p10，6?24 h该片段表达显著增加；S+细胞在感染后1?6 h内无p10表达，感染后24 h可检测到该片段，但显著低于同时间点S-细胞的表达水平，差异有统计学意义； 3. I L-1β前体与成熟IL-1β: S-和 S+细胞感染HCMV后1 h，pro-IL-1β表达量均显著增加并持续至感染后6 h，但在感染后24 h，S-细胞显著下降，S+细胞稍有下降;S-细胞的IL-1β于感染后1 h开始增加，持续至24 h;而S+细胞的IL-1β在感染后1 h和6 h相当于感染前水平，感染后24 h时该蛋白才表达增加，但显著低于同时间点S-细胞的表达水平，差异有统计学意义； 三、HCMV被膜蛋白pUL83与细胞AIM2蛋白发生相互作用 1. pM-UL83和pVP-AM2重组表达载体构建成功且可在HEK293T细胞中表达； 2.双杂交实验检测到pM-UL83、pVP-AIM2和SEAP报告基因在共转染HEK293T细胞后SEAP含量显著增加； 3.免疫共沉淀实验检测到pM-UL83和 pVPAM2的表达产物DNABD-pUL83和AD-AIM2蛋白发生相互作用； 4.免疫共沉淀检测到HCMV感染THP-1源性巨噬细胞后6-12 h，pUL83蛋白同AIM2蛋白发生相互作用。其中，12 h时相结合的蛋白较多；免疫荧光共定位检测到二者共定位于胞质中； 四、pUL83通过结合AIM2蛋白下调AIM2炎性体通路 1.成功构建ASC、 caspase-1和IL-1β重组表达载体；Western-blot检测到rHEK293T细胞可以表达AIM2、ASC、pro-caspase-1和pro-IL-1β蛋白； 2. poly(dA:dT)转染rHEK293 T细胞后，pro-IL-ip蛋白表达量较转染前明显增加， caspase-1活化片段p10以及成熟I L-1β出现；p M-U L83重组表达载体转染rHEK293T细胞后再转染poly(dA:dT)时，pUL83蛋白高表达，然而 AIM2、pro-caspase-1、pro-IL-ip、p10和成熟IL-1β蛋白水平较转染pM-U L83前大幅度减少，ASC蛋白量也有所降低； 3. poly(dA:dT)在有或无pUL83表达的情况下转染rHEK293T(AIM2-)细胞，ASC、pro-caspase-1和pro-IL-ip蛋白水平无变化，且与转染前水平相当；均无p10和成熟IL-ip蛋白表达。 结论： 1. HCMV感染THP-1源性巨噬细胞后诱导AIM2炎性体组装，促进成熟IL-1β和IL-18释放和细胞死亡； 2. AIM2蛋白是介导HCMV感染早期诱导巨噬细胞炎性体活化的必要感受器； 3. AIM2炎性体活化可在一定程度上抑制HCMV的早期和晚期基因转录； 4.在HCMV感染早期，病毒被膜蛋白pUL83可同细胞AIM2蛋白在胞质中结合； 5. pUL83结合AIM2蛋白可负向调节AIM2炎性体通路。