动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)及其导致的心脑血管疾病已经成为严重威胁人类生命和健康的一类主要疾病。据世界卫生组织统计，AS是导致西方发达国家居民死亡的主要病因，而其在我国的发病率也在逐年上升。AS发生是一个多因素导致的复杂过程，其中Ross提出的氧化损伤-炎性反应学说被认为是AS发病机制中最重要的假说。该假说认为，血浆中氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)引起的内皮细胞氧化损伤是AS发生的始动环节。oxLDL可诱发内皮细胞氧化应激、内皮依赖的血管舒张功能下降、血栓形成以及炎症反应，进而导致血管AS病变。近几十年来，越来越多的研究表明，AS的发生与不健康的生活方式，特别是不合理的膳食习惯密切相关，世界卫生组织的资料表明近50%的AS可通过改善饮食等生活方式来加以预防，提示研究如何通过膳食途径有效预防AS具有十分重要的理论和现实意义。流行病学调查表明，蔬菜、水果等植物性食物的摄入可显著降低AS及冠心病的发病率，提示植物性食物中含有能预防AS发生的有效成分。进一步研究发现类黄酮化合物(flavonoids)是植物性食物中一类重要的预防AS的生物活性成分。类黄酮化合物属于天然植物化学物(phytochemicals)中的多酚类化合物，种类繁多，因其结构不同分为六类：黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、黄烷醇、异黄酮和花色苷，其中花色苷是植物中存在的天然色素，广泛存在于各类有色水果和蔬菜中。人群干预研究结果显示，每天摄入600mg花色苷，能够显著增加血浆总抗氧化度，减少血管炎性介质的产生，从而降低AS和冠心病的发病率。然而，花色苷抗AS作用的相关机制尚未完全阐明。一方面，体内代谢和生物利用的研究发现，花色苷吸收后体内清除速率快、半衰期短，导致其生物利用率很低，这与花色苷显著的心血管保护效应形成了明显的反差，提示其中可能存在血管内皮或血管壁组织对花色苷的有效摄取和组织靶向分布。另一方面，近期研究发现，血管内皮细胞自噬在动脉粥样硬化发生发展中扮演重要角色。适度的自噬能通过降解细胞内氧化损伤物质，尤其是线粒体，保护内皮细胞抵抗氧化应激的损伤，从而抑制动脉粥样硬化的发生发展。花色苷是否能够通过诱导细胞自噬抑制内皮细胞氧化损伤，以及相关作用机制如何，还有待进一步研究。本实验室前期对21种膳食中常见的花色苷化合物进行了药效学筛选实验，筛选出了抑制血管内皮细胞氧化应激损伤效应最显著的花色苷化合物——飞燕草素葡萄糖苷(delphinidin-3-glucoside，Dp)。本课题旨在前期工作的基础上，深入研究飞燕草素葡萄糖苷在血管内皮细胞的摄取利用及抑制内皮细胞氧化损伤效应的分子机制。我们首先在动物实验和原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)实验中，利用Dp的自发荧光特性，采用高效液相色谱(HLPC)、激光共聚焦扫描显微镜等方法，研究了Dp在血管内皮细胞中的跨膜转运、定位分布以及动脉血管壁组织吸收特征，并发现钠依赖性葡萄糖转运体(sodium dependent glucose transporter1，SGLT1)在Dp跨膜转运中发挥重要作用；然后通过构建oxLDL诱导的HUVECs氧化应激损伤体外细胞模型，观察Dp对HUVECs活力、凋亡、自由基水平、及线粒体功能障碍、线粒体凋亡相关蛋白表达的影响；最后，我们利用电子显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、siRNA、Western blot等方法及特异性抑制剂，探讨了Dp对内皮细胞自噬的影响以及AMPK/SIRT1/自噬信号通路在Dp抑制内皮细胞氧化应激损伤机制中的作用机制。实验结果：(1)利用Dp的自发荧光特性，研究结果显示，Dp可被内皮细胞摄取并在细胞中以原型形式存在，主要分布在内皮细胞的细胞浆和细胞膜；小鼠尾静脉注射Dp后发现Dp持续存在血管壁分布。免疫荧光细胞化学法检测发现内皮细胞存在SGLT1的细胞膜表达，沉默SGLT1后HUVECs对Dp的摄取被显著阻断，提示HUVECs对Dp的摄取利用至少部分是依赖SGLT1实现的。(2)利用oxLDL诱导的内皮细胞氧化损伤体外模型，研究结果表明，Dp能显著抑制oxLDL导致的内皮细胞凋亡，并增加细胞活力。对线粒体功能障碍的研究表明，Dp能显著抑制oxLDL诱导的ROS和O2-等自由基增加，线粒体膜电位（△ψ）降低及线粒体膜通透性转换孔（mPTP）持续开放，结果提示：Dp能抑制oxLDL导致的细胞线粒体功能障碍。通过siRNA沉默SGLT1受体并进而抑制Dp被内皮细胞摄取，结果表明，oxLDL诱导的凋亡因子AIF、Cyt C、Bax、Caspase-3表达增加，抗凋亡因子Bcl-2表达降低，实验结果表明，Dp能显著抑制oxLDL诱导的内皮细胞氧化应激损伤。(3)Dp预处理可剂量依赖性的提高oxLDL处理的内皮细胞自噬水平，增强内皮细胞对氧化应激的保护性反应；利用自噬抑制剂可显著削弱Dp对oxLDL诱导的内皮细胞凋亡的抑制作用，提示：Dp可通过诱导细胞自噬抑制内皮细胞氧化应激损伤。进一步研究发现Dp能显著上调AMPK和SIRT1的表达水平，采用AMPK和SIRT1的siRNA和特异性抑制剂能显著降低Dp诱导的细胞自噬。研究表明：Dp可能通过AMPK-SIRT1诱导内皮细胞自噬，抑制内皮细胞氧化应激损伤。全文结论：Dp能够被血管内皮细胞有效摄取及存在血管壁持久分布，并通过抑制线粒体功能障碍从而抑制内皮细胞氧化损伤，该作用可能通过活化AMPK/SIRT1/自噬相关信号通路实现。