头孢喹肟是第一个动物专用的第四代头孢菌素类抗生素,与第三代头孢类抗生素相比,具有抗菌谱广,生物利用度高、抑菌活性强,对细胞膜的穿透力强等特点。目前,兽医临床上主要用其治疗奶牛乳房炎、子宫内膜炎、牛和猪呼吸道疾病等。头孢喹肟的不合理使用,造成在动物源性食品中的残留,对人的健康造成潜在的危害,甚至引发食品安全与公共卫生问题。因此,欧洲药物评价委员会对头孢喹肟在牛和猪的可食性组织中最大残留量做出了明确的规定。当前,用于兽药残留仪器检测的方法因预处理繁琐、成本高、干扰条件多、灵敏度不稳定等缺点,难以在实际工作中广泛使用,然而,免疫学检测法具有快速、简便、成本低等优点被广泛应用于前期筛选,提高后期工作的效率,也确保了实验结果的可靠性。目前国内外有关头孢喹肟免疫学检测的文献报道较少。本研究根据头孢喹肟结构特点合成人工抗原;通过细胞融合技术制备出具有特异性高、敏感性强的抗头孢喹肟单克隆抗体;建立能稳定分泌头孢喹肟单克隆抗体细胞株,为后续免疫学检测方法的建立提供良好基础。1.头孢喹肟完全抗原的合成与鉴定利用碳二亚胺法,将头孢喹肟与载体蛋白(BSA和OVA)进行偶联,获得免疫原CEF-BSA和包被原CEF-OVA。经紫外光谱扫描、SDS-PAGE凝胶电泳、免疫学方法鉴定,可初步判断人工抗原偶联成功。利用BCA法测得CEF-BSA和CEF-OVA的蛋白浓度分别是4.2 mg/mL和4.6 mg/mL。2.头孢喹肟单抗的制备人工抗原CEF-BSA免疫BALB/c小鼠,采集血液并测定其血清效价,血清效价高于1:16000。利用细胞融合技术和有限稀释法,筛选出2株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为2E5和4G7。杂交瘤细胞注入小鼠腹腔,获得腹水型单克隆抗体。经Protein GHP亲和层析纯化柱纯化后,2E5单克隆抗体效价是1:32000。交叉实验结果表明,该单抗与药物头孢氨苄、头孢噻呋、头孢噻吩、洛美沙星、青霉素没有交叉反应,单抗特异性良好。3.ELISA检测方法的建立纯化后的腹水,通过间接竞争ELISA方法,筛选出包被原最佳工作浓度1:6000和纯化后抗体最佳工作浓度1:8000。当CEF的浓度在50～5000 ng/mL时,2E5细胞株单抗线性回归方程为y=0.2854 x-0.189,相关系数R2=0.9904,IC50=258.42 ng/mL,LOD=5.87 ng/mL,LOQ=20.54 ng/mL。4.鲜奶中头孢喹肟添加回收实验鲜牛奶样品中CEF添加回收实验,当对牛奶样品稀释8倍后,基本可除去牛奶样品中基质的干扰。当CEF的浓度在20～2000 ng/mL范围内线性回归方程为y=0.4493x-0.5184,相关系数 R2=0.9874,IC50=183.76 ng/mL,LOD=15.30 ng/mL,LOQ=106.03ng/mL。通过用低(500 ng/mL)、中(1000 ng/mL)、高(2000 ng/mL)三种CEF标准液做添加回收实验,测得鲜奶中回收率在82.73%～102.15%之间。