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猪链球菌(Streptococcus.suis)属革兰氏阳性、兼性厌氧球菌,按荚膜多糖分为35个血清型(1-34和1/2型),其中猪链球菌2型是最主要的致病源且流行性广泛,其次是血清型1/2,7,9和14型。能引起猪的关节炎、脑膜炎、肺炎、败血症、心内膜炎、多发性浆膜炎、流产和脓肿等。目前临床上较多应用灭活苗和弱毒苗预防猪链球菌感染,灭活疫苗含有少量毒力因子,对致病菌攻击的保护效率不理想,仅能保护同源菌株的感染。而弱毒苗虽然能产生较好的抗体滴度,但存在毒力返强以及潜在的生物安全性问题。因此,广谱性新型疫苗的研究成为养殖业发展的重要需求和保障。根据已发表的相关序列,设计合成了两对特异性引物分别用于扩增溶血素基因和38KDa基因主要抗原区基因。应用PCR方法扩增猪链球菌2型四川分离株的相关基因,将PCR产物纯化后与pMD18-T连接,提取阳性质粒,进行PCR和酶切鉴定,同时进行测序分析。构建原核表达载体pET32a-Sly、pET32a-38KDa,大小为35Ku和43Ku。Western-blot分析结果表明,纯化的重组蛋白与兔源猪链球菌2型阳性血清发生特异性反应。两种重组蛋白分别具有Sly与38KDa蛋白的中和表位。确定诱导表达的两种蛋白都具有免疫原性后,提取阳性克隆质粒进行NcoⅠ、BamHⅠ和BamHⅠ、XhoⅠ双酶切并纯化,T4DNA连接酶连接两片段,通过用Sly上游引物和38KDa蛋白的下游引物进行PCR扩增串联两片段通过PCR串联两片断,将目的片断定向克隆到表达载体pET32a中,测序正确后,重组质粒转化入大肠杆BL21(DE3),用终浓度为0.8mmol/L IPTG进行诱导表达,结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量约为60Ku的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法(Western-blot)证实该重组蛋白可以与兔源猪链球菌2型阳性血清发生特异性反应。用纯化的重组表达蛋白pET32a-Sly,pET32a-38KDa和pET32a-Sly-38KD分别乳化免疫BALB/c小鼠,评价其免疫保护性,并和猪链球菌2型全菌灭活疫苗进行比较。首免7天、14天后采血。2周后加强免疫1次,采血2次,并在每次免疫后采血测其效价。二免2周后,用致死剂量强毒猪链球菌2型四川分离株,江苏分离株以及马链球菌兽疫亚种菌株,腹腔和肌肉注射攻毒,并观察攻毒试验后小鼠的临床保护效应和存活情况。结果表明,三种重组蛋白的各实验组IgG抗体水平之间无显著差异(P>0.05)。免疫组Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅳ组对不同分离株强毒猪链球菌2型以及感染马链球菌兽疫亚种安徽分离菌株的免疫保护性组间无显著差异(P>0.05),与Ⅱ组相比差异显著(P<0.01)。各免疫组中与阳性对照组相比差异显著(P<0.01)。免疫组死亡小鼠的平均存活时间延长与阳性对照组比较差异显著(P<0.01),菌苗效应指标中,免疫组Ⅲ组和Ⅳ组对S.suis2四川株保护力之间无差别;Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组对S.suis2江苏株之间差异不显著(P>0.05);Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组对马链球菌兽疫亚种安徽分离株保护力无差别。Ⅰ组相对Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组差异不显著(P>0.05)。结论说明三种重组疫苗对不同分离株的保护率无差异,可以诱导小鼠的体液免疫应答并对强毒株猪链球菌2型攻击感染起到保护作用。