第一部分　　 烟碱对发育过程中海马AMPA和NMDA受体的调制作用　　 烟碱型乙酰胆碱能受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR,或称烟碱受体)是由乙酰胆碱激活的阳离子选择性通透的配体门控通道,是由α亚基(α2-α10)和β亚基(β2-β4)构成的同源(α7-α9)或异源(αXβY)性五聚体。脑内以异源性α4β2和同源性α7亚型受体最多。nAChR的表达在出生后早期即达到高峰,并持续存在于整个成年过程。除了乙酰胆碱,nAChR还可以被烟碱激活。　　 海马位于大脑颞叶内,分别位于左右脑半球,是大脑边缘系统的一部分,担当着记忆以及空间定位的作用。α7和α4β2这两种乙酰胆碱受体在海马区域有丰富的表达,广泛存在于海马的锥体神经元和中间神经元。　　 烟碱-胆碱能神经元通过释放乙酰胆碱,激活nAChR发挥作用。烟碱-胆碱能信号通路广泛分布于中枢神经系统,对中枢神经系统的功能起着重要的调节作用。一方面,它与大脑的高级神经-精神活动(如觉醒、认知、激惹、注意、疼痛和记忆等)密切相关,另一方面,它参与了多种神经病理性疾病(如老年性痴呆,帕金森氏症,精神分裂症,癫痫以及抽动秽语综合症等)形成和发展；此外,它还与成瘾的形成有关。　　 突触主要由轴突组成突触前膜,树突组成突触后膜。谷氨酸是脊椎动物中枢神经系统内主要的兴奋性递质。突触前神经元释放谷氨酸,通过突触间隙与突触后神经元膜上的谷氨酸受体结合而发挥作用,谷氨酸神经通路与海马功能密切相关。中枢神经系统的谷氨酸受体包括AMPA受体和NMDA受体,主要位于兴奋性突触的突触后膜上,介导突触传导,并参与突触可塑性的形成和维持。AMPA受体的数量决定了突触后神经元兴奋的程度,是中枢神经系统影响突触传递的主要决定因素。它在突触后膜区和突触后膜外区存在的数量比的稳定性对于大脑信息的储存是具有非常重要的意义。因此,了解烟碱对AMPA受体和NMDA受体在大脑神经元,尤其是在树突上分布的影响具有重要意义。　　 尽管对nAChRs的研究由来已久,但人们对烟碱信号传导系统在大脑发育过程中的作用所知甚少。近年来的研究发现,nAChRs激活与大脑各功能区域的发育成熟密切相关。出生后一周,海马区域的α7和α4β2 nAChRs的表达水平即达到高峰,此时恰恰是谷氨酸突触刚刚开始形成的时期,也是中枢神经系统许多区域自发性兴奋性活动开始活跃的时期。早期神经系统局部通路的形成与信号的传导同样也受到烟碱信号转导系统的调节。此外,有研究证明,哺乳动物在围产期过多地接触烟碱,其大脑的认知功能会受到严重的损害,表明过度激活烟碱信号传导系统可损害与学习记忆相关的大脑的发育。这些研究提示:nAChRs在大脑发育过程中对谷氨酸信号系统的发育和成熟可能有着重要的影响。　　 研究烟碱信号传导系统在大脑发育过程中对谷氨酸信号系统的影响,对了解神经系统的发育规律和机制,以及烟碱对神经功能的调节作用机理和损伤机制有重要的理论意义。　　 目的:　　 本研究采用电生理,免疫荧光染色以及western blot等方法,以体外培养海马神经元,体外培养脑片以及基因敲除小鼠脑片为模型,观察烟碱及其信号通路对海马神经元谷氨酸释放、对AMPA和NMDA受体在树突表面分布及其在神经元中表达的影响。　　 方法:　　 在体外培养的大鼠海马神经元、小鼠海马培养脑片以及基因敲除小鼠海马脑片上,用全细胞膜片钳记录微小兴奋性突触后电流(mEPSC),分别分析烟碱及其信号传导对mEPSC频率和幅度的影响。mEPSC反映了单个微小囊泡递质的释放,它的频率反映了突触前谷氨酸囊泡释放的数目,它的幅度反映了突触后受体(例如AMPA,NMDA受体)功能或数目的变化。　　 在体外培养海马神经元上,采用双电极外置刺激的方法,使用全细胞膜片钳记录AMPA和NMDA受体诱发兴奋性突触后电流(evoked-EPSC),观察烟碱对这两种受体evoked-EPSC峰值的影响。它的峰值反应了最大的可激活的突触电流。　　 在体外培养海马神经元上,采用多通道快速给药的方法,使用全细胞膜片钳记录AMPA和NMDA受体诱发电流(AMPAR-induced和NMDAR-inducedcurrent)。　　 在体外培养海马神经元上,用Western Blot检测AMPA受体的蛋白表达水平。　　 在体外培养海马神经元上,通过免疫荧光共染色GluR1,PSD95受体簇,观察烟碱对AMPA受体在树突表面分布的影响。　　 为避免烟碱直接的α7和α4β2型烟碱受体作用,所有烟碱长期暴露的细胞模型在记录前均使用含特异性α7和α4β2型烟碱受体阻断剂MLA和DHβE的培养液取代含烟碱的培养液孵育1小时。　　 结果:　　 1.在体外培养大鼠海马神经元上记录mEPSC,发现1μM烟碱持续作用7天后,mEPSC的频率与对照组相比显著增加；而烟碱持续作用1小时,并不改变mEPSC的频率。烟碱联合应用特异性α7型烟碱受体阻断剂MLA共同作用7天后,mEPSC的频率也无显著变化。烟碱联合应用特异性α4β2型烟碱受体阻断剂DHβE7天后,mEPSC的频率显著增加。上述各实验组与对照组相比,mEPSC的幅度均无显著差异。α7nAChRs广泛地分布于突触前和突触后,其作用与受体分布的区域密切相关:分布于突触前可以调节突触的释放,分布于突触后可以引起神经元去极化。以上结果表明,烟碱主要通过α7nAChRs,促进突触前谷氨酸囊泡释放的数目,而不影响突触后受体功能或数目的变化,即烟碱主要通过作用于突触前膜的α7型烟碱受体,促进谷氨酸递质的释放。　　 2.在体外培养的小鼠海马脑片上,发现烟碱持续作用5天后,mEPSC的频率显著增加,幅度无显著性变化。此结果进一步表明,烟碱主要作用于突触前膜的烟碱受体,促进谷氨酸的释放。　　 3.在野生型小鼠(WT mice)、α7型烟碱受体基因缺陷小鼠(α7KO mice)和α4β2型烟碱受体基因缺陷小鼠(α4β2KO mice)脑片上记录mEPSC,发现与WT小鼠相比,α7KO小鼠mEPSC的频率显著减小；而α4β2KO小鼠mEPSC的频率无明显变化。3组小鼠的mEPSC幅度均无显著差异。结果表明:内源性的α7型烟碱受体胆碱能信号传导缺陷导致谷氨酸释放减少或功能性突触减少。　　 4.NMDA受体和AMPA受体共同存在于大多数中枢神经系统兴奋性突触的突触后膜,参与突触的传导和突触的可塑性。实验中在体外培养海马神经元上记录AMPA和NMDA受体介导的兴奋性突触后电流(AMPA-evoked和NMDA-evokedEPSCs),发现烟碱作用7天后AMPA和NMDA受体介导的的兴奋性突触后电流均显著性增加,且NMDA/AMPA的比例保持不变。结果表明:烟碱主要通过突触前机制促进谷氨酸释放,且对AMPA和NMDA受体介导的突触成分作用强度相似。　　 5.在体外培养海马神经元上使用GluR2缺失的AMPA受体亚型的特异性阻断剂Naspm(100μmol/L)后,AMPA受体介导的兴奋性突触后电流无明显变化,且烟碱对此过程无显著性影响。此外,AMPA受体介导的兴奋性突触后电流并未呈现出明显的内向整流特性。结果显示:在我们的体外培养海马神经元上,几乎所有的AMPA受体均含有GluR2亚型,且烟碱不引起该亚型构成的变化。　　 6.在体外培养海马神经元上记录AMPA和NMDA受体诱发电流(AMPAR-induced和NMDAR-induced current),发现对照组和烟碱处理7天组的NMDA和AMPA诱发电流密度无显著性变化。结果表明:烟碱对谷氨酸信号通路的影响是通过突触前机制,而非突触后机制。　　 7.Western-blot结果显示,烟碱长期作用不改变海马神经元AMPA受体中GluR1以及GluR2/GluR3亚基的蛋白表达水平。　　 8.在体外培养海马神经元上,通过免疫荧光共染色GluR1和PSD95受体簇,发现烟碱长期作用组的GluR1受体簇,PSD95受体簇,以及树突表面两者共定位的受体簇显著多于对照组。由于GluR1和PSD95受体簇的共定位是活性突触的标志,结果提示:烟碱促进了AMPA受体在突触的聚集,且这种聚集是由于新生突触造成的。　　 结论:　　 1.烟碱主要作用于突触前膜的α7型烟碱受体促进谷氨酸的释放,且对AMPA和NMDA受体介导的突触成分作用强度相似。　　 2.α7型烟碱受体-胆碱能信号传导缺陷将导致谷氨酸释放减少或功能性突触形成减少。　　 3.烟碱促进AMPA受体在突触区域的聚集,但不影响细胞膜表面总体分布水平和总蛋白表达水平。　　 第二部分卡维地洛对海马CA1区神经元瞬时外向钾电流和延迟整流钾电流的作用　　 研究背景:卡维地洛是β-肾上腺素受体拮抗剂。除能阻断β-受体外,卡维地洛还具有许多非β-受体拮抗效应。卡维地洛脂溶性高,容易透过血脑屏障到达大脑。研究证明,卡维地洛在脑缺血性损伤和其它损伤时有很好的神经元保护作用,但其机理不明；目前认为与清除自由基、金属螯合、以及抑制神经元膜离子通道(如Na、Ca)和受体(如NMDA受体)而产生的抗炎、抗细胞凋亡和线粒体保护作用有关。　　 钾离子(K+电流)可以调节神经元的兴奋性,参与多种神经生理活动；此外,许多病理状况也与神经元钾离子通道的异常活动有关。海马CA1区锥体神经元上的外向钾电流主由两个电压门控性钾电流成分组成,分别是瞬时外向钾电流(IA)和延迟整流钾电流(IK)。IA是生理状态下与细胞兴奋活动密切相关的钾电流,而IK是病理状态下细胞内钾离子大量外流的主要通道。有报道,中枢神经系统的很多病理状态与K+外流的增多有关(如缺氧,缺血,低血糖和抑郁症等)等。越来越多的证据表明,IK增加可诱导神经元的凋亡。　　 上述研究的结果提示:卡维地洛有可能通过影响K+通道而发挥神经元保护作用的。但迄今为止,尚未见有卡维地洛通过影响K+通道而发挥神经元保护作用的报道。　　 目的:　　 本研究采用全细胞膜片钳技术研究卡维地洛对离体大鼠海马CA1区锥体神经元钾电流(IK和IA)的影响。　　 方法:　　 在急性分离的大鼠海马CA1区神经元上应用全细胞膜片钳技术研究卡维地洛对瞬时外向钾电流(IA)和延迟整流钾电流(IK)的作用。　　 结果:　　 卡维地洛(0.1-3μmol/L)呈浓度依赖性、电压非依赖性地抑制了IK,其半数抑制浓度IC50为1.3μmol/L;对IA峰值无明显影响。进一步的通道动力学表明,IA和IK的激活曲线未受到1μmol/L卡维地洛影响,但其稳态失活曲线显著左移；此外卡维地洛还延缓了它们的复活。对于卡维地洛对IK峰值的选择性作用于的机制我们也做了初步探讨,研究发现相应的α1、β受体激动剂和阻断剂均不能改变卡维地洛对IK的抑制作用,但另一种β受体阻断剂普奈洛尔可以产生与卡维地洛相似的效应。　　 结论:　　 这些结果提示卡维地洛是IK的开放性阻滞剂,且其阻断IK的效应与其自身的α1＼β受体拮抗作用无关。由于IK是细胞内钾离子大量外流的主要通道,因而卡维地洛可以通过这种高选择性发挥神经保护的作用。