万寿菊中玉米黄质的合成调控

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玉米黄质(Zeaxanthin)是天然的类胡萝卜素之一,也是一种保健品添加剂,在预防老年性黄斑变性(致盲的主要原因)、白内障、心血管疾病和癌症等方面都起着重要的作用。由于人体无法合成玉米黄质,只能从膳食中获得,因此,玉米黄质在食品工业等方面需求很大。在植物中,玉米黄质常与叶黄素共存,导致玉米黄质的制备比较困难,而利用合成生物学的方法制备玉米黄质过程复杂、成本太高,所以目前不具有商业前景,这使得能够提升玉米黄质的合成量成为一个亟待解决的问题。万寿菊比较容易获得,且玉米黄质含量较高,因此研究万寿菊中玉米黄质的合成具有重要意义。本研究以提高玉米黄质合成量为出发点,克隆了万寿菊中玉米黄质合成途径中下游关键酶玉米黄质环氧化酶基因的片段,并找到了对万寿菊进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的最适宜条件,建立方法筛选诱变得到的高玉米黄质合成量的突变体,以解决玉米黄质需求短缺的状况。首先,本文利用分子生物学的手段,由玉米黄质合成途径的玉米黄质环氧化酶(ZEP)入手,ZEP位于玉米黄质合成途径的下游,催化玉米黄质生成环氧玉米黄质、紫黄质,ZEP基因的敲除或者沉默对提高玉米黄质合成量具有重要作用。本研究中,根据不同物种的ZEP基因进行序列比对找到保守区域设计简并引物,提取万寿菊(Tagetes erecta L)花瓣中的总RNA,并反转录成c DNA,以其为模板成功克隆万寿菊ZEP基因片段(命名为Te ZEP)。同源性分析结果表明,万寿菊Te ZEP基因片段长度1058 bp,编码352个氨基酸残基,并且其序列与其他植物ZEP基因同源性最大为92%,之后对序列进行了多方面的分析,包括与其他物种进化树分析,以及Te ZEP基因编码氨基酸的理化性质预测、可能含有的蛋白功能结构域及蛋白质三级结构预测。这为进一步研究该基因功能提供了依据,也为构建转基因植物和沉默基因植株以提高玉米黄质合成量提供了一定的参考。同时,从化学诱变入手,利用一种稳定有效的化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS),在不同浓度与时间梯度对万寿菊种子进行诱变,找到了最适宜诱变的条件为:EMS诱变浓度为1%,诱变时间16 h。开展万寿菊的EMS化学诱变技术研究,不仅能够获得各种各样的突变体材料,为筛选高玉米黄质的突变株提供了良好的材料基础,还为提高玉米黄质合成量提供了新方法、新思路。然后,通过对传统测定类胡萝卜素的有机溶剂萃取条件进行优化,使类胡萝卜素提取和测量方法高效,再用薄层层析方法分离得到叶黄素,最后利用紫外分光光度计测量方法测定类胡萝卜素和叶黄素的含量,并大致估算玉米黄质的含量。测量方法在吸光值0.2-0.8范围内可信,不仅省时而且操作简便,旨在从大量的突变体中筛选到对我们而言较有利的突变植株,比如玉米黄质合成量较高的植株。综上所述,我们成功克隆了万寿菊Te ZEP片段,为后续利用沉默技术达到提高玉米黄质的合成提供基础,由此可以达到调控玉米黄质合成量的目的。此外,我们构建了万寿菊EMS诱变群体,为后续开展万寿菊的遗传改良及筛选突变体提供基础研究材料和支撑。并进一步优化玉米黄质的提取和检测方法,高效快速的筛选高玉米黄质含量的植株。
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