美洲大蠊纤溶活性蛋白的分离纯化及其性质的研究

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美洲大蠊(Periplaneta Americana L.)是中药蟑螂类的学名,又称香娘子、负盘、茶婆虫等,为节肢动物门蜚蠊目大蠊属。在众多药用昆虫中,蟑螂,种类繁多、分布广泛,本身含有丰富的微量元素、蛋白质、必需氨基酸、肽类等多种营养物质,古中药曾记载其具有活血化瘀、利水消肿、解毒等功效。其在抗高血压、血管硬化、肝炎、烫烧伤治疗等方面也具有显著的药理作用,但传统医用都是以全虫入药,对具体药效成分及药理机制知之甚少。本文从美洲大蠊体内提取出一种纤溶活性蛋白成分,首先对其进行纯化、活性检测工作,再研究其体内外抗栓、增强纤溶的具体作用,并确定安全性。肿瘤治疗一直是居高不下的热点问题,随着传统医学的觉醒,中药医肿瘤的研究备受关注,基于该需求,本文还研究了该纤溶蛋白对肿瘤细胞生长增殖、死亡及凋亡的作用,具体研究内容如下:本文通过组织匀浆浸提得到分段粗蛋白,再经过深度硫酸铵盐析、阴离子交换等方法,从美洲大蠊体内分离得到一种单体纤溶活性蛋白(Fibrinolyric Proteins,FP),初步检测目的蛋白纤溶活性良好。电泳证明其纯度为单一组分蛋白,其相对分子量约为16 k D。为进一步了解FP的理化性质,本实验还研究了不同理化性质对该活性蛋白的影响。分析单因素实验结果发现该活性成分在4℃和35℃左右较稳定,65℃及以上活性丧失,金属K+、Na+和EDTA对其基本上没有影响,Ba2+和βME对其有轻微抑制作用,Fe3+几乎完全抑制了FP活性。该蛋白最适p H为7左右。此外,考虑到未来应用临床可能性,本文还对提取的FP进行安全性评估实验,建立健康小鼠模型注射目的蛋白,证明其没有急性毒性,不会引起机体产生溶血反应,没有明显的出血现象,小鼠体内外抗栓实验现象均证明其具有抗栓作用。血栓与肿瘤转移关系密切。本文尝试性的对该蛋白的抗癌作用做了初步研究,通过体外培养人卵巢癌细胞OVCAR-3,人胃癌细胞SCG-7901,分别给予不同浓度梯度的纤溶活性蛋白,作用于同一细胞的抑制效果不同,结果显示其对OVCAR-3的抑制作用较好,对SCG-7901细胞的抑制作用不明显,目标蛋白对增殖抑制具有选择性。OVCAR-3细胞荧光染色表明蛋白能调控癌细胞死亡或凋亡进程。该研究成果为血栓性疾病及肿瘤的核靶向诊治提供一定理论基础。然而,它含有的纤溶蛋白是否有直接损伤肿瘤细胞的作用和具体抑制作用的机理,以及其促血管生成的机制等,还有待继续深入研究。
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