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自2010年以来,坦布苏病毒感染（Tembusu virus infection,TMUV infection）作为一种新发疫病,持续危害我国水禽养殖业的健康发展。TMUV主要感染鸭,以产蛋鸭产蛋大幅下降、雏鸭及育成鸭神经症状为主要特征。作为黄病毒属成员,TMUV宿主范围广泛,包括各品种鸭、鹅、蚊子、野鸟、小鼠甚至人都可感染并携带TMUV,给我国的公共卫生安全带来极大挑战。为了有效防控TMUV感染,我国研制了基因工程疫苗、弱毒疫苗与灭活疫苗,但在免疫防控过程中,仍存在现有疫苗免疫效果不佳、免疫保护力差等诸多问题。研究表明,外泌体是病毒尤其是RNA病毒感染借助的工具之一。由于外泌体与细胞膜都具有脂质双分子层,可保护其内容物不受降解,即使经长时间、远距离运输,仍能保持生物活性,同时也可逃逸机体免疫监视,更有利于病毒的扩散。因此,探究TMUV与外泌体之间的关系,以及外泌体在TMUV感染过程中的作用,可为TMUV感染的防控与新型生物制品的研制奠定理论基础。主要研究内容如下:1、TMUV感染细胞源外泌体的分离鉴定由于TMUV与外泌体在粒径分布范围具有重叠性,常用的分离方法无法将外泌体与病毒分开。因此,首先采用超速离心法对外泌体进行分离提取,然后利用CD63免疫磁珠对TMUV感染HD11细胞与HEK293细胞产生的外泌体进行纯化。通过纳米流式技术检测外泌体粒径分布范围、Western Blot检测外泌体表面标志物、TEM观察外泌体形态等,对外泌体的一系列表征进行鉴定。结果显示,通过该方法分离纯化的外泌体纯度较高,外泌体呈杯状,粒径分布范围30 nm～200 nm,其表面标志物为阳性,内质网标志物为阴性,且可与游离的病毒粒子分开,无TMUV污染。2、TMUV感染对外泌体释放的影响为进一步探究TMUV感染对外泌体释放的影响,本研究通过纳米流式检测分析颗粒浓度,结合Western Blot检测外泌体表面标志物TSG101,证实TMUV感染会显著促进HD11与HEK293细胞外泌体的分泌。此外,为明确TMUV感染产生的外泌体中是否含有病毒成分,通过提取纯化后外泌体中RNA检测病毒核酸,以及蛋白质谱分析检测病毒蛋白,结果显示,纯化后的TMUV-exosomes中包含TMUV全基因组序列,且含有TMUV C蛋白、pr M蛋白、E蛋白、NS1蛋白、NS2B蛋白、NS4B蛋白与NS5蛋白;不含NS2A蛋白、NS3蛋白与NS4A蛋白。利用本实验室制备的TMUV 3种单克隆抗体通过Western Blot检测验证了TMUV-exosomes中包含TMUV E蛋白、pr M蛋白与NS5蛋白。此外,除病毒成分外,本研究还利用非标记定量蛋白组学技术鉴定出TMUVexosomes与Mock-exosomes中含有宿主蛋白共5360个,其中52个蛋白上调,130个蛋白下调,有无差异蛋白共1106个。这些宿主蛋白涉及细胞内吞、囊泡运输、病毒感染、细胞自噬等过程,表明TMUV感染后会引起细胞内宿主蛋白的上调与下调,从而被包裹到外泌体中的成分迥异。3、外泌体对TMUV复制的影响为进一步探索外泌体在TMUV感染过程中的作用,以及外泌体对TMUV复制的影响,首先利用PKH67标记对照组和感染组外泌体,而后将其分别与HEK293细胞和HD11细胞共孵育,激光共聚焦观察到TMUV-exosomes可以被细胞主动摄入。等量TMUV与TMUV-exosomes分别接种细胞,结果显示,TMUV-exosomes可在受体细胞中建立增殖性感染,但与TMUV感染相比,TMUV-exosomes对HEK293细胞感染效率低。提取不同时间点Mock-exosomes与TMUV-exosomes,与细胞共孵育后显示12 h与24 h提取的外泌体均可显著促进TMUV的复制,且TMUV-exosomes能够抑制细胞内干扰素及刺激基因与肿瘤坏死因子的相对表达量。利用GW4869外泌体释放抑制剂处理HEK293细胞后结果显示,GW4869可抑制HEK293细胞外泌体的产生,同时也能显著抑制细胞内TMUV的复制。TMUV感染HEK293细胞后,用10μM GW4869处理24 h提取外泌体,WB检测TMUV-exosomes中包含的TMUV蛋白成分,结果显示,GW4869可抑制TMUV-exosomes中TMUV蛋白表达水平,且对细胞的感染性也显著下降,表明抑制HEK293细胞外泌体分泌后,可显著抑制TMUV的复制与扩散。此外,为探究TMUV-exosomes是否能够不依赖受体传播,本研究通过制备并纯化TMUV E蛋白,进行受体封闭试验,结果表明受体封闭后TMUV感染性显著下降,但TMUV-exosomes对细胞的感染性不受影响,从而证实TMUV-exosomes可经非受体依赖途径介导细胞的感染。4、TMUV感染细胞源外泌体促进TMUV复制的机制研究为探究TMUV-exosomes促进TMUV的复制机制,本研究筛选了前期非标记定量蛋白组学结果中与外泌体分泌及运输相关的Rab27a蛋白,以确定其在外泌体释放与TMUV复制过程中的作用。首先对TMUV感染HEK293细胞后的Rab27a表达量进行检测,结果显示TMUV感染显著促进Rab27a的表达;接着通过过表达Rab27a蛋白后,进行病毒感染,结果显示,过表达Rab27a蛋白也可显著促进TMUV的复制;过表达Rab27a蛋白后,接种TMUV,提取外泌体,证实Rab27a可显著促进HEK293细胞外泌体的分泌,且外泌体中TMUV蛋白表达量也显著升高。由于TMUV感染后可显著促进外泌体释放,因此为确定TMUV何种蛋白成分对外泌体释放具有促进作用,通过过表达TMUV 3个结构蛋白与7个非结构蛋白,利用Western Blot与q RT-PCR检测细胞内、外Rab27a与TSG101表达量,结果显示,过表达TMUV NS4A蛋白后,Rab27a与TSG101蛋白表达量与基因相对表达量显著上升。过表达TMUV NS4A蛋白后,提取外泌体检测TSG101表达量,结果显示,TMUV NS4A蛋白可显著促进外泌体的释放。以上结果显示,TMUV感染可促进外泌体的释放,而TMUV-exosomes可反过来促进TMUV的复制,当抑制外泌体分泌后,TMUV的复制也受到显著抑制,同时,TMUVexosomes可介导TMUV非受体依赖途径感染细胞。在TMUV与TMUV-exosomes的相互作用过程中,TMUV-NS4A蛋白以及宿主Rab27a蛋白发挥了重要作用,即TMUVNS4A蛋白可通过上调Rab27a的表达从而促进包裹有TMUV核酸与蛋白成分的外泌体释放,进而向周围或远距离未感染细胞传递病毒和宿主成分,以促进TMUV的传播与扩散。