发酵酸肉是以新鲜猪肉为原料,加入米粉、盐等调味品,在自然状态下利用微生物进行厌氧发酵而成,是一类有两千多年历史的发酵肉制品。目前主要流行于我国重庆、四川、贵州、广西、湖南等地,是侗族、苗族、傣族和毛南族等少数民族生活中必需的肉食产品,有着丰富的饮食文化内涵和广泛的食用基础。本论文以自制发酵酸肉为原材料,从中筛选具有降低胆固醇功效的乳酸菌,并通过生理生化和分子生物学方法对菌株进行鉴定、模拟体外消化环境测定菌株的生理特性,并对其降胆固醇机理进行初步研究。为发酵酸肉的功能作用和工业化生产提供基础研究数据,为降胆固醇乳酸菌的研究和应用提供原始菌株和基础研究支持。1.降胆固醇乳酸菌的筛选及鉴定1.1降胆固醇乳酸菌的筛选结果以自制发酵酸肉为原材料,以划线分离纯化的方法在碳酸钙-MRS培养基分离得到乳酸菌。通过鸡蛋黄为胆固醇源筛选出18株具有降胆固醇能力的乳酸菌菌株。其中,SR1和SR10两菌株胆固醇降低率>30%,占总比例的11.11%；仅有1株胆固醇降低率在10%以下,占总比例的5.57%。其余菌株胆固醇降低率在10%～30%之间。降胆固醇能力最强的SR10和最弱的SR18胆固醇降低率分别为32.78%、7.17%。说明发酵酸肉中生长的乳酸菌具有降胆固醇的能力,可降低发酵猪肉制品中胆固醇的含量,但不同菌株降胆固醇能力有差异。通过初筛,选择降胆固醇能力较强的SR1、SR3、SR4、SR7、SR9、SR10、 SR12、SR17八株乳酸菌株进行两次复筛,测得胆固醇降低率都>20%。其中以鸡蛋黄为胆固醇源测得胆固醇降低率最强的四株菌株是SR10、SR12、SR1和SR7；以胆固醇胶束为胆固醇源测得降胆固醇能力最强的四株菌株是SR10、SR1、SR4和SR12。考虑到鸡蛋黄中含有蛋白质和卵磷脂等物质,可能会影响菌体降胆固醇的效果。综合初筛和复筛的筛选结果,选择在以胆固醇胶束为胆固醇源中降胆固醇能力最强的SR10和降胆固醇能力较强的SR1为目的菌株进行后续实验,以胆固醇胶束为胆固醇源测得菌株SR10和SR1胆固醇降低率分别为35.73%、31.89%。1.2降胆固醇乳酸菌的鉴定及鉴定结果将筛选出的胆固醇降低率较高的两株乳酸菌SR1和SR10进行鉴定,两株菌株其菌落生长良好,呈圆形,边缘整齐,正面中央凸起,表面湿润光滑,不透明,呈乳白色。油镜下观察,菌体呈现杆状,革兰氏染色后菌体呈现紫色(G+)。进行过氧化酶、吲哚及糖醇等生理生化试验,鉴定结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》进行对比,并结合形态学观察结果初步判断SR1和SR10菌株为乳杆菌。采用16SrRNA分子生物学方法,对菌株DNA进行提取、扩增、测序,获得两菌株SR1和SR10基因片段大小分别为1476bp和1480bp。测序结果在GenBank基因库中进行比对,与基因库中消化乳杆菌16SrRNA基因序列的同源性为99%,结合形态学和生理生化结果鉴定SR1和SR10均为消化乳杆菌。2.发酵酸肉中已筛选的降胆固醇乳酸菌的生理特性研究2.1已筛选降胆固醇乳酸菌生物学特性研究结果测得SR1和SR10生长的最适pH为6.0-7.0,SR1的最低生长pH为3.4,最高生长pH为10.2。SR10的最低生长pH为2.8,最高生长pH为10.2。SR1和SR10最适生长温度都为30℃。与大部分乳酸菌的最适合生长温度和pH吻合。测定SR1和SR10的生长曲线。SR1在4h左右从生长期进入对数期,10h左右进行稳定期。SR10培养6h左右从生长期进入对数期,培养12h左右进行稳定期。两株乳酸菌的产酸速率随着菌体密度的增加而提高,在培养过程中pH值不断降低,特别是菌体从生长期到对数期下降较为明显,当进入稳定期后pH基本保持稳定。SR1和SR10的生长曲线中最低pH值都约为4.0。2.2已筛选降胆固醇乳酸菌模拟消化耐受性研究结果根据耐酸性实验,在pH为2.0、2.5、3.0的条件下对菌株培养6h后,SR1存活率分别为30.11%,38.55%,45.61%；SR10的存活率分别为38.02%,48.53%,58.47%。表明SR1和SR10都有较强的耐酸性,且SR10较SR1对酸性环境的耐受性更强。说明筛选菌株在酸性条件下具有较强的存活率。根据耐胆盐性实验,在0.1%,0.2%胆盐条件下SR1和SR1培养8h后能够正常生长,在0.3%胆盐条件下生长受到抑制,经过8h培养后测得SR1存活率为43.01%,SR10的存活率为39.73%。说明筛选菌株具有较强的耐胆盐性。选用20种抗生素进行药敏实验,在接种后的平板培养基上放入抗生素纸片,测得SR1的最大和最小的抑菌圈直径分别为强力霉素37.85mm,卡那霉素7.85mm；SR10的最大和最小的抑菌圈直径分别为美满霉素38.03mm,庆大霉素7.44mm。说明抗生素对筛选菌株有不同程度的抑制作用,但不同抗生素对不同菌株抑制其生产情况不一样。3.筛选降胆固醇乳酸菌的降胆固醇机制初步研究结果3.1降胆固醇乳酸菌降胆固醇能力与时间关系及其分析结果对消化乳杆菌SR10进行同化作用和沉淀作用分析,测得12h和24h同化作用胆固醇降低率分别为14.98%和20.89%；沉淀作用胆固醇降低率分别为9.42%和12.80%。说明在整个菌株生长过程中同化作用和沉淀作用同时存在,且同化作用较沉淀作用降胆固醇的效果更加明显。本实验验证了菌体在降胆固醇作用中,同化和沉淀作用同时存在,且在整个过程中同化作用起主要作用。3.2降胆固醇乳酸菌酶来源及活性研究结果通过分别添加TritonX-100和硫酸铵两种试剂对粗酶液进行提取,并测定酶活力和蛋白质含量。其中经饱和度为70%的硫酸铵对粗酶液提取效果最好,分别测得胞外和胞内酶活力为176.2U/mL,305.3U/mL；蛋白质含量为2.45mg/mL,0.49mg/mL；比活力为70.5U/rmg,611.8U/mg。酶活力胞内粗酶液为胞外粗酶液的1.7倍,蛋白质浓度胞外粗酶液为胞内粗酶液的5倍,胞内酶比活力是胞外酶比活力的8.7倍。说明在降胆固醇作用中酶主要来源于胞内,且在降胆固醇作用中胞内酶起主要作用。