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向日葵锈病(Puccinia helianthi Schw.)是向日葵重要病害之一,严重危害向日葵的品质及含油量。向日葵锈菌分泌的胞外蛋白酶是其致病因子之一,这种蛋白酶破坏植物细胞外部保护屏障,有利于病菌侵入,导致寄主感病。本研究基于前期实验室对向日葵锈菌转录组数据分泌蛋白的筛选,从中挑出一条表达量较高的基因(KU994904)进行分析,首先进行该基因生物信息学分析,以确定它的主要的功能,命名为金属蛋白酶(metalloproteinase,mep),其次克隆了该金属蛋白酶基因,构建相关原核载体进行体外表达,同时对其亚细胞定位,确定其主要作用位点,为实验室今后进一步研究该蛋白的致病机制奠定了基础。主要取得以下结果:1.生物信息学分析。该金属蛋白酶成熟基因序列长1335bp,编码445个氨基酸,利用在线软件 SignalP4.1 Server、TMpred、big-PI predictor 及 TargetP 1.1 确定此蛋白酶为胞外分泌蛋白,通过NCBI进行比对,其与M36家族中5条序列具有较高相似性,并利用SWISS-MODEL基于同源建模的方法检索PDB(protein data bank)蛋白质结构数据库,发现同胞外金属蛋白酶基因序列相似度达到53.77%,因此,推断其为胞外分泌金属蛋白酶。2.原核表达。利用密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program(V13)对序列进行优化,采用全基因克隆方法同pET30a表达载体连接,成功构建原核表达载体pET30a-金属蛋白酶。将重组质粒转到BL21菌株中,利用O.lmM IPTG进行重组蛋白诱导表达。重组质粒在15℃和37℃下诱导16h均可大量表达,利用不同浓度咪唑洗脱蛋白质,确定蛋白酶存在于包涵体中。将蛋白质通过Ni-IDA亲和层析进一步纯化,通过Bradford方法测定蛋白浓度为0.558 mg/mL。最后,利用Western-blot进行验证,证实该蛋白为目的蛋白,其蛋白分子量约为49.5kDa。3.亚细胞定位分析。利用T4连接酶成功构建表达载体pCambia1302-eGFP,将表达载体转到农杆菌GV3101,进一步将带有表达载体的农杆菌GV3101转化到本氏烟草,观察亚细胞定位结果。发现向日葵锈菌金属蛋白酶定位于烟草细胞外部的屏障上(细胞壁或细胞膜),推测向日葵锈菌胞外分泌的金属蛋白酶主要作用于细胞外部屏障,通过破坏寄主细胞组织结构成分促进其侵染。