P450单加氧酶为一类在自然界中广泛分布的酶,由于其催化反应的多样性已被广泛应用于代谢,药物合成等领域。天然P450单加氧酶存在产物选择性低的问题,难以满足工业生产的需要,故对P450单加氧酶的的产物选择性优化已成为该类酶研究的重要方向。P450氧化酶结构与反应机理复杂,严重限制了其结构研究及设计改造研究。针对以上问题,本论文选择了有机经典产物选择性反应:反马氏规则氧化反应和硝基取代反应,分别以来源于Labrenzia aggregate的反马氏规则氧化P450 aMOx和来源于Streptomyces scabies的硝基取代反应P450TxtE H176F为研究对象,进行了产物选择性设计改造的相关研究,获得了高产物选择性的新型P450单加氧酶,推动了P450单加氧酶的工业应用进程。本论文的第一章概述了P450单加氧酶的来源,定义,分类,反应机理及应用现状,同时对本论文的研究基础与研究思路进行了简要叙述。本论文的第二章构建了P450 aMOx的大肠杆菌异源表达系统,采用亲和层析为纯化方法,获得了高产率高纯度的酶。同时开发了P450 aMOx的酶学性质检测方法。在高效异源表达系统和酶学检测方法的基础上,对P450 aMOx进行理性设计探究。本论文的第三章为P450 aMOx的理性设计改造,本章提出“蝴蝶”催化模型,该模型为酶催化反马氏规则反应的产物选择性改造提供了参考。本章以苯乙烯为底物,通过同源建模和分子对接获得了P450 aMOx与底物的可能结合构象。通过分子动力学模拟确认了影响其反马氏规则产物选择性的关键因素:反应距离以及底物反应位点出现在反应距离内的频率。基于以上分析结果,采用MM/GBSA结合自由能分析获得影响底物关键位点,采用第二章的方法构建了设计突变的大肠杆菌异源表达系统,经实验验证获得突变A275G使得P450 aMOx的反马氏规则产物选择性从81%提高到＞99%。本论文的第四章构建了自给自足型P450 TxtE H176F BM-3R的大肠杆菌异源表达系统,采用亲和层析为纯化方法,获得了高产率高纯度的酶。同时开发了P450 TxtE H176F BM-3R的酶学性质检测方法。在高效异源表达系统和酶学检测方法的基础上,对P450 TxtE H176F BM-3R进行理性设计探究。本论文的第五章为TxtE H176F-BM 3R的理性设计改造,提出了“时钟”催化模型,该模型可为酶催化的硝基取代反应提供指导。本章以已解析的TxtE H176F晶体结构（PDB ID:5D3U）为基础,采用QM精确计算出反应过程中过渡态机制为过氧亚硝酸盐过渡态。基于以上结果,采用分子动力学模拟与虚拟饱和突变相结合设计影响TxtE H176F-BM 3R硝基取代反应产物选择性的突变,并开发了高效分离和鉴定不同取代位点硝基-L-色氨酸（NTs）的检测方法,采用第四章的方法构建了设计突变的大肠杆菌异源表达系统,经实验验证获得突变I244M、V63F、A248F,成功实现了该酶催化底物L-色氨酸的产物从5-硝基-L-色氨酸（5NT）到6-硝基-L-色氨酸（6NT）的转变,对6NT的选择性分别为50%,99%和＞99%。