【摘 要】
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终止子是一个特殊的发夹结构,3’末端紧随着一串多聚U序列,其主要功能终止基因转录。另外,有个别研究显示终止子在转录后阶段也有一定的作用。然而,目前对终止子在这两方面的具体调控程度尚没有具体研究,序列组成和二级结构对其功能的具体影响还不明确,并且终止子对转录和翻译两个层次的调控幅度也缺乏量化比较分析。针对以上问题,本论文通过建立终止子的全面表征策略,以及将高通量的DNA和RNA测序结合流式分选技术,
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终止子是一个特殊的发夹结构,3’末端紧随着一串多聚U序列,其主要功能终止基因转录。另外,有个别研究显示终止子在转录后阶段也有一定的作用。然而,目前对终止子在这两方面的具体调控程度尚没有具体研究,序列组成和二级结构对其功能的具体影响还不明确,并且终止子对转录和翻译两个层次的调控幅度也缺乏量化比较分析。针对以上问题,本论文通过建立终止子的全面表征策略,以及将高通量的DNA和RNA测序结合流式分选技术,对终止子突变库序列进行初步的结构-功能分析,并得到以下结论:(1)从基因转录、翻译和总体调控三个方面对终止子的强度进行表征,定义了3个终止子的特征参数,分别为转录终止程度(α)、上游mRNA保护能力(β)和体现终止子整体作用效果的表观终止效率(η)。对应于3个特征参数,我们分别构建了3个基于双荧光报告基因体系的终止子探针质粒(p TK-d R、p TK-s R和p TK)从多角度表征小型终止子文库中12个终止子的强度。通过多元回归分析发现,转录终止程度和上游mRNA保护能力对表观终止效率的贡献度相当。对12个终止子的序列碱基组成分析表明,终止子茎结构中GC碱基占比与转录终止程度有一定的正相关性。(2)设计终止子突变模型,利用简并碱基突变构建了库容为2134条的终止子突变库。采用流式细胞分选的方法,将终止子突变库序列按上下游基因的表达强度差异分为了7个亚群,并且突变库中下游荧光基因相对表达强度跨度为5.09倍。通过对高通量测序的统计,发现不同强度终止子调控表达上下游基因存在一定的反比关系(R~2=0.5412)。分析认为可能由于强终止子使RNA聚合酶等转录因子的循环利用率提高,同时对其上游基因mRNA保护能力可能也会有所增强。在终止子序列碱基组成方面,经过对终止子序列各突变位点上的4种碱基相对频率进行统计分析,得到关键位点N13、N12、N29和Y27。对终止子的二级结构进行预测,并比较了终止子突变库序列的发夹环和U-tract结构对相对终止效率分数的影响,分析发现终止子发夹环和U-tract之间存在一定的交互作用。(3)将终止子突变库进行RNA测序,得到一个库容为2440的终止子突变库序列。经统计,推测基因转录终止位点可能在终止子下游36 bp处,并验证了终止子对mRNA水解的保护作用。另外,我们发现,从下游基因表达量的角度评价终止子强度会高估其实际终止转录的水平,而从转录水平的定量分析则能更加准确地评价终止子强度。在终止子的构效关系中,分析得到对终止率影响较大的突变位点为N9、N12、N20和N29。其中,N12和N29位点与DNA测序分析得到的终止子序列关键位点一致。综上,本研究建立了全面的终止子表征策略,并构建了强度跨度为5.09倍的终止子元件库,通过对终止子的结构-功能关系的解析,补充了终止子调控机制的基础信息,并为终止子理性设计和运用提供了指导。
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