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从药用植物内生真菌的次级代谢产物中寻找具有生物活性的物质是当前研究的热点。海南粗榧(CephalotaxushainanensisLi)因其组织中含有显著抗白血病功效的三尖杉酯碱类物质,因此从该类植物中筛选内生真菌、并从其次级代谢产物中筛选具有类似活性的抗癌药物成为了获取该类药物的替代途径。本实验室长期从事海南粗榧内生真菌的相关研究,前期已分离筛选获得了一株能产生高抗白血病活性物质高三尖杉酯碱(HHT)的内生真菌CH1307,并已被鉴定为细极链格孢(Alternaria tenuissima)。已开展的研究中对其液态发酵产HHT的发酵条件等进行了优化,并适当提高了产量,但发现该菌株液态发酵合成HHT的产能以及产量水平不稳定,同时其菌落形态特征趋于多变性。因此,本文在对该菌株进一步分离纯化和鉴定的基础上,探讨发酵方式对菌株次级代谢产物合成水平的影响,并且进一步对其次级代谢产物具体成分进行结构鉴定以及活性评价。主要研究如下:(1)菌株CH1307进一步纯化及分子鉴定通过传统真菌形态学鉴定方法对保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心的菌株细极链格孢CH1307进行进一步分离,发现其菌落形态趋于分化,因而对该菌株菌落形态进行研究,依据菌落直径、高度、形状、正反面颜色、气生菌丝形态、色素产生与否等将CH1307划分为五种形态型(CH1307a、CH1307b、CH1307c、CH1307d和CH1307e)。同时,对这五种形态型菌株进行显微观察,发现这五株菌株的菌丝形态相似,其中菌株CH1307c观察到有孢子。并且利用分子生物学手段对这五种形态型菌株的rDNA的ITS序列进行测序、比对分析以及系统发育关系验证,结果显示,这五种形态型的菌株ITS序列相同,同属于链格孢属(Alternaria)。(2)五种形态型菌株次级代谢产物初探鉴于菌株CH1307菌落形态多变,虽然暂时未鉴定出是否属于不同种,但产量的不稳定性以及有变种的可能,因此对其次级代谢产物进行初探。通过化学实验、液相色谱分析以及抗菌、抗癌细胞毒活性四个角度对五种形态型菌株的次级代谢粗提物进行初步分析。结果显示,五种形态型菌株的化合物类别丰富,涵盖了7个类别的化合物类型;液相色谱图出峰多,在0-45min范围内都有紧凑的出峰现象,且以CH1307c的出峰情况最复杂且许多出峰位点峰值最高,CH1307d、CH1307e次之,而CH1307a、CH1307b峰值总体相对较低。另外,抗菌活性测试表明,五种形态型菌株的次级代谢产物对7种供试菌株(Escherichia coli Stapylococcu aureus,Bacillus subtilis,Streptococcus agalactiae,Rhizoctonia solani,Sclerotinia sclerotiorum,Fusarium oxysporum f.sp.Cubense)均无抑制作用;而对三株常见白血病细胞(细胞K562、NB4、HL60)显示出一致的细胞毒活性,且对细胞NB4、HL60的抑制效果较好,其IC50值均在28-46μg/mL之间。鉴于菌株CH1307c是唯一一株跟踪到产孢的菌株,且合成的化合物种类最多及含量最高。因此,选取CH1307c作为进一步研究的目的菌株。(3)发酵方式对菌株CH1307c次级代谢产物促合成的影响鉴于该菌株液态发酵产能及产量不稳定的情况,因此采用OSMAC(单菌多化合物one strain-many compounds)法探究不同发酵方式对菌株CH1307c次级代谢产物合成水平的影响。结果显示不同发酵方式对菌株CH1307c次级代谢产物的产量以及化合物类别影响较大,大米固态发酵、麦麸固态发酵的次级代谢粗提物产量相对于马铃薯动态发酵分别增加了 45.9倍和28倍;另外,马铃薯动态发酵比静置发酵产量高9.1倍。试管定性试验结果表明大米固态发酵获得的粗提物化合物种类最多,麦麸发酵和动态发酵次之,马铃薯液态静置发酵最少。此外,四种发酵方式获得的代谢粗提物对7种供试菌株(Escherichia coli,Staphylococcu aureus,Bacillus subtilis,Streptococcus agalactiae,Rhizoctonia solani,Sclerotinia sclerotiorum,Fusarium oxysporum f.sp.Cubense)均无抑制作用;同时对3株细胞(细胞K562、NB4、HL60)的细胞毒活性也无明显差异,且都对细胞NB4、HL60的抑制效果显著,其IC50值均在30-40μg/mL之间。因此,选择大米固态发酵方式对该菌株进行进一步的研究。(4)菌株CH1307c次级代谢产物的结构鉴定及活性评价采用大米固态发酵方式对菌株CH1307c进行大批量发酵。发酵培养物用乙酸乙酯进行集中提取,得到代谢粗提物200.4g,运用硅胶柱层析、薄层层析以及重结晶等方法对其进行分离纯化,以超导核磁共振对分离的化合物进行分析,最终得到8个单体化合物,它们分别是:化合物1为PestalotiopinA,化合物2为β-谷甾醇,化合物3为链格孢酚的5-O-硫酸盐,化合物4为链格孢酚甲醚,化合物5为7-羟基-6-甲氧基香豆素,化合物6为Cerevisterol,化合物7为Oblongolide V,化合物8为3-Methoxyphenoxy。并且测定该8个化合物对血癌细胞K562、NB4的细胞毒活性,结果显示该8个化合物对这两株细胞均无活性。目前未分离获得目标产物HHT及其类似物,也未获得对白血病细胞株有活性的其它化合物,但目前建立的方法对目标完成具有借鉴和指导意义,同时已获取的23个馏分为后续工作的开展也奠定了基础。