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中药是中医治病的物质基础,其安全问题不容忽视。中药材从种植、采收、加工到贮藏过程都极易受到真菌侵染,真菌污染导致的中药霉变是影响中药质量与安全的主要问题之一,真菌产生的次级代谢产物真菌毒素具有致癌、致畸、遗传毒性、生殖紊乱和免疫抑制等作用,严重威胁着人类的健康。由于中药材品种多,来源复杂,使用范围广,受真菌污染情况复杂,准确评价难度大,需要全面的调查和分析,因此建立快速准确的中药材污染真菌鉴定方法是解决这个难题的关键。1目的通过对不同来源的15种45份中药材表面污染真菌的分离鉴定,以及对菌株产毒性能进行检测,探索一种中药材表面污染真菌的快速鉴定方法,为全面了解中药材真菌污染状况,实现中药材真菌毒素污染的预警报告奠定基础。2方法2.1中药材表面真菌的分离、纯化与培养利用平板稀释法,对从广西、湖南、湖北三个地区的零售店购买的15种45份中药饮片表面污染真菌进行分离、纯化与培养。2.2菌株的显微鉴别利用乳酸酚棉蓝染色法对分离得到的菌株进行显微观察,做初步的鉴定。2.3真菌的分子鉴定选取文献中常用的真菌鉴定通用引物ITS1/ITS4,以及自行设计的ITS引物Wen1F/Wen1R、Wen2F/Wen2R,以分离到的菌株基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得目的片段,测序并进行序列比对。2.4菌株产毒性能的检测根据显微观察和分子鉴定的结果以及有关参考文献,对部分菌株进行液体培养,采用LC-MS/MS方法对其培养物中的黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)、赭曲霉毒素A (OTA)及杂色曲霉毒素(ST)检测。3结果3.1中药材表面分离菌的情况及显微鉴别结果在检测的45份药材中43份检出有真菌污染,污染率达95%,真菌污染情况较为普遍。从实验的中药材样品表面共获得143株真菌,经过初步的形态学观察主要为子囊菌类和半知菌类,其中曲霉属(Aspergillus spp.),青霉属(Penicillum spp.)数量最多,是所测样品中的主要污染菌属。湖北样品中共分离到真菌44株,其中曲霉属17株,占38%,青霉属5株,占11%；湖南样品中共分离到真菌42株,曲霉属12株,占28%,青霉属10株,占23%；广西样品中共分离到真菌57株,曲霉属15株,占26%,青霉属19株,占33%。3.2分子鉴定结果利用基于ITS序列的分子鉴定方法对所得的143株真菌进行鉴定,117株鉴定到属以上。曲霉属共39株,其中杂色曲霉(Aspergillus versicolor)7株,烟曲霉(Aspergillus fumigatus)4株,黄曲霉(Aspergillus fiavus)和棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)各3株；青霉属共34株；枝孢菌属(Cladosporium spp.)10株；散囊菌属(Eurotium spp.)5株；小光壳属(Leptosphaerulina spp.)3株、镰刀菌属(Fusarium spp.)3株；拟青霉属(Paceilomyces spp.)2株；链格孢属(Alternaria spp.)2株；炭团属(Hypoxylon spp.)2株；其他菌属17株；另有26株菌株未能准确分类。3.3菌株产毒性能的结果利用LC-MS/MS对110株菌株培养物中AF(B1、B2、G1、G2)、OTA及ST进行检测,结果发现枸杞样品分离到的1株黄曲霉检测到AFB1、AFB2；甘草、穿心莲、枸杞、太子参和苦杏仁样品中分离到的5株杂色曲霉检测到ST；当归、党参、甘草样品中分离到的3株棘孢曲霉检测到OTA。4结论本研究通过优化真菌分离方法、设计ITS序列分析引物等初步建立起了中药材表面污染真菌分离和分子鉴定的方法,为中药材真菌污染的检测提供了一个较为切实可行的手段。利用本方法完成了三个地区15种45份中药材表面污染真菌的分离和鉴定,并利用LC-MS/MS方法对分离菌株的产毒性能(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2, OTA, ST)进行了检测。结果显示所检测的中药材受真菌污染普遍,曲霉属和青霉属为优势真菌群,其中包括黄曲霉、杂色曲霉、棘孢曲霉等产毒真菌,提示了部分中药材存在真菌毒素污染的潜在危险,需要加以关注