土壤盐渍化和次生盐渍化在全球范围内造成严重的生态和环境问题。胡杨（Populus euphratica）是我国西北荒漠和半荒漠地区唯一成林的多年生木本植物,也是研究树木耐盐生理与分子机制的模式树种。在高盐胁迫下,胡杨能够有效的排出胞内积累的Na+,同时减少K+的外流,维持K+/Na+平衡,以缓解高盐胁迫造成的盐害作用。转录调节因子如WRKY在胡杨抵御盐胁迫过程中具有重要的调控作用。实验室前期研究表明,盐诱导胡杨Pe WRKY1基因上调表达,Pe WRKY1能够通过促进转基因烟草根细胞中Na+的外排,提高转基因株系的耐盐性。更为重要的是,Pe WRKY1转基因植株根细胞在盐胁迫下能显著提高质子泵活性以维持离子平衡,但Pe WRKY1对质膜（PM）H+-ATPase的调控机制尚不明确。本文旨在通过筛选胡杨Pe WRKY1下游靶基因,揭示Pe WRKY1响应盐胁迫调控质子泵活性与离子平衡的信号传导网络。通过体外蛋白纯化系统获得Pe WRKY1蛋白,利用DNA亲和纯化测序（DAP-Seq）技术筛选到转录因子Pe WRKY1下游的互作基因Pe HA1（质膜H+-ATPase）和Pe MAX2（More Axillary Branches2,植物腋芽分支基因）。通过建立胡杨酵母双杂交文库,进一步筛选到与Pe MAX2相互作用的蛋白Pe GRP2（RNA结合蛋白（RBP）中的甘氨酸富集蛋白）。再将Pe WRKY1及其互作基因Pe MAX2和Pe GRP2分别在模式植物中过表达,解析基因功能。论文通过研究转录因子Pe WRKY1与Pe HA1、Pe MAX2的互作以及Pe MAX2与Pe GRP2蛋白的相互作用,建立了胡杨响应盐胁迫调控离子平衡的Pe WRKY1-Pe HA1/Pe MAX2-Pe GRP2信号转导网络。本文得到的主要结果如下:1、胡杨Pe WRKY1和Pe HA1响应盐胁迫上调表达。Na Cl（200 m M）处理后,胡杨根和叶中Pe WRKY1、Pe HA1基因的表达量明显增强,而且Pe WRKY1对盐胁迫的响应早于Pe HA1。为确定基因启动子对盐诱导Pe HA1表达的重要性,根据NCBI中胡杨基因组PM H+-ATPase基因序列信息设计引物,通过PCR扩增得到2022 bp的Pe HA1基因启动子序列。顺式元件分析表明Pe HA1启动子序列中含有能与WRKY转录因子结合的W-box元件。构建了胡杨Pe HA1-pro::GUS融合蛋白表达载体,并转化至模式植物烟草中进行盐诱导表达。Na Cl处理后转基因植株根尖、叶肉、叶脉和茎的维管组织中GUS活性增强,说明胡杨中Pe HA1的上调表达是由于其启动子被盐处理激活所致。DAP-Seq结果显示Pe HA1为Pe WRKY1下游的靶基因,酵母单杂交（Y1H）、凝胶迁移（EMSA）和萤光素酶报告基因等实验结果进一步验证了Pe WRKY1能与Pe HA1启动子中的W-box顺式作用元件结合,促进Pe HA1的转录表达。在胡杨中利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）证明了Pe WRKY1与Pe HA1的相互作用:在Pe WRKY1基因沉默的叶片中,Pe HA1的表达量在盐处理后也随之下调。Pe WRKY1基因转化实验结果显示,Pe WRKY1转基因烟草在盐胁迫下PM H+-ATPases活性增强,一方面促进H+的外排,为Na+/H+逆向转运提供驱动力,另一方面维持膜电势超极化,降低去极化激活的外向型K+通道和非选择性阳离子通道介导的K+流失,从而维持体内K+/Na+的平衡。Pe WRKY1转基因烟草PM H+-ATPases活性与Nt HAs基因的表达量密切相关:Nt HA2和Nt HA4在盐胁迫下均上调表达,而且Nt HA4的表达量在对照及盐处理条件下均高于野生型和转空载体株系。通过设计引物克隆Nt HA2和Nt HA4的启动子序列,分别克隆得到1963 bp的Nt HA2基因启动子序列和1912 bp的Nt HA4基因启动子序列,顺式作用元件分析显示Nt HA4基因的启动子序列中含有能与WRKY的结合元件W-box。因此,胡杨Pe WRKY1通过与转基因烟草Nt HA4启动子中的W-box顺式作用元件结合,提高质膜H+-ATPase基因的转录水平,进而增强了质子泵活性,提高了K+/Na+平衡的维持能力。2、胡杨Pe MAX2是Pe WRKY1下游的互作基因。为确定Pe MAX2基因功能,以胡杨c DNA为模板PCR克隆到Pe MAX2基因CDS区的全长序列。Pe MAX2基因的CDS区全长2106 bp,共编码701个氨基酸。多重序列比对分析结果表明,胡杨Pe MAX2蛋白含有F-box结构域。亚细胞定位结果显示,Pe MAX2-GFP蛋白主要在细胞核表达,与转录因子Pe WRKY1蛋白的定位一致;而空载体的GFP蛋白则在细胞核和细胞质中均匀分布。将Pe MAX2在拟南芥中过表达研究其对耐盐性的作用。Pe MAX2能缓解高浓度Na Cl（125 m M）对拟南芥根长生长的抑制作用,减少Na Cl对拟南芥细胞膜的伤害。同时,盐胁迫下Pe MAX2能促进拟南芥Na+的外排,减少体内Na+的积累,还能减少K+的外流,维持K+/Na+平衡,进而缓解过多盐分对植物的伤害。为了研究胡杨Pe MAX2的盐诱导表达,利用PCR克隆得到1902 bp的Pe MAX2基因启动子DNA序列,且其启动子中含有W-box顺式作用元件。将Pe MAX2-pro::GUS转入烟草,发现Pe MAX2基因启动子响应盐胁迫,增强下游基因的表达。VIGS验证了Pe WRKY1与Pe MAX2的相互作用,Y1H进一步证明了Pe WRKY1与Pe MAX2-pro的W-box互作。因此,在盐胁迫下,胡杨Pe WRKY1能够与Pe MAX2基因的启动子相互作用提高基因的表达,Pe MAX2通过促进Na+外排、减少K+流失,维持植物体内K+/Na+的平衡,缓解Na Cl对植物的伤害。蛋白-蛋白互作的研究表明,Pe MAX2通过负调控RNA结合蛋白（RBP）中的甘氨酸富集蛋白Pe GRP2,实现对胞内离子平衡的调控。3、通过建立胡杨酵母双杂文库筛选得到的Pe MAX2的互作蛋白Pe GRP2,并在胡杨中克隆到编码基因Pe GRP2。该基因全长405 bp,编码134个氨基酸。为确定Pe GRP2基因功能,在拟南芥中异源表达,发现Pe GRP2负调控植物耐盐性。盐胁迫下Pe GRP2转基因拟南芥根尖Na+的外排能力明显低于野生型和转空载体拟南芥,造成Na+的过度积累和盐害作用。亚细胞的定位结果表明,Pe GRP2-GFP蛋白主要在细胞核表达,与其互作的Pe MAX2蛋白的定位一致。酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（Bi FC）、双分子萤光素酶报告基因（Bi LUC）等实验结果进一步确认了Pe MAX2与Pe GRP2的相互作用。再利用原核表达纯化的Pe MAX2、Pe GRP2蛋白进行体外蛋白酶体降解实验,结果显示,Pe MAX2能促进Pe GRP2的降解,而蛋白酶体抑制剂MG132处理抑制了Pe GRP2的降解,这说明胡杨Pe MAX2参与Pe GRP2的蛋白酶体降解途径,降低其对Na+积累的促进作用,进而提高胡杨的耐盐性。综上,胡杨Pe WRKY1响应盐胁迫上调表达,Pe WRKY1与Pe HA1和Pe MAX2启动子的W-box相互作用,调控靶基因的表达,Pe WRKY1通过以下两条途径提高胡杨离子平衡的调控能力:（1）Pe WRKY1与Pe HA1互作增强基因表达,Pe HA1的上调表达提高了质膜H+-ATPase活性,质子泵建立的跨膜电化学势驱动Na+/H+逆向转运,同时,质膜的超极化也降低了K+经由去极化激活的外向型K+离子通道及阳离子通道介导的K+外流;（2）Pe WRKY1与Pe MAX2互作提高靶基因表达,Pe MAX2通过负调控Pe GRP2抑制Na+的积累,提高了Na+离子平衡调控能力。总之,本文建立了胡杨离子平衡调控的Pe WRKY1-Pe HA1/Pe MAX2-Pe GRP2的信号网络,深入阐明了胡杨响应盐胁迫的分子机制。