背景与目的:鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)是一种能够引起多宿主感染的专性胞内寄生菌,其感染不同宿主能够引起不同感染性疾病,包括人、禽鸟、家畜以及部分哺乳动物均是Cps的易感宿主。近年来,Cps感染性疾病在世界范围内均呈逐年递增趋势,2019年全球Cps在人和动物中的感染率以及发病率已达十年来新高。有效防控Cps感染对于保障公众卫生健康、促进国家畜牧业发展具有重要意义。而疫苗接种作为预防衣原体感染的最佳方式,也越来越受到人们的重视。尽管多年来衣原体在减毒活菌疫苗、亚单位疫苗等方面已取得了一定成绩,但由于上述疫苗仍存在毒副作用大、效力不强等局限,到目前为止尚无临床可用的衣原体抗感染疫苗。多表位融合疫苗是目前疫苗研究的热点,其具有抗原特异性强、致敏成分少、稳定性高等特点,较传统疫苗更具优势,然而有关衣原体多表位融合疫苗的报道仍然较少。因此,本研究拟通过生物信息学预测鉴定Cps MOMP以及CPSIT_p6蛋白的优势抗原表位,并以此为基础构建Cps多表位融合抗原,评估其免疫原性以及抗感染保护作用。随后通过设计最佳的免疫策略,同时构建新型疫苗佐剂,以进一步优化、完善Cps的多表位融合疫苗。本研究将为衣原体疫苗的设计开发提供新的思路与依据,对未来Cps的防控具有重要意义。方法:1.GenBank查找Cps MOMP以及CPSIT_p6蛋白的氨基酸序列,通过DNAStar分析蛋白的二级结构,IEBD预测蛋白的亲水性、柔韧性、表面可及性,随后采用SYFPEITHI软件评估蛋白序列中的潜在T细胞位点并计算抗原指数。最后根据以上分析综合预测MOMP以及CPSIT_p6蛋白的优势抗原表位片段。2.构建MOMP以及CPSIT_p6蛋白的优势抗原表位肽段,通过腹腔注射免疫BALB/c小鼠3次后,取血清检测IgG、IgA抗体评估体液免疫应答水平;取BALB/c小鼠脾细胞检测各肽段对脾细胞增殖的影响,以及刺激脾细胞分泌细胞因子IFN-γ以及IL-10的水平。3.构建MOMP以及CPSIT_p6的多表位融合抗原,腹腔注射免疫BALB/c小鼠后,检测血清IgG、IgM、IgA以及IgG亚类抗体水平。取BALB/c小鼠脾细胞上清检测细胞上清IFN-γ、IL-2、IL-4以及IL-10的分泌水平;末次免疫2w后,最佳Cps感染剂量滴鼻感染BALB/c小鼠,10 d后取肺组织进行Cps包涵体计数、H&E染色以及免疫组化染色评估融合抗原的抗感染保护作用。4.多表位融合抗原腹腔注射免疫BALB/c小鼠3次后,取脾细胞进行磁珠分选分别消耗CD4+或者CD8+细胞,随后将分选后的脾细胞过继转移至新的BALB/c小鼠体内。1d后Cps滴鼻感染BALB/c小鼠,感染7 d后处死小鼠取肺组织进行Cps包涵体计数。5.采用滴鼻、肌肉联合免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫2 w后取血清、鼻腔灌洗液以及生殖道灌洗液分别检测血清抗体以及分泌型IgA水平(sIgA);ELISA、流式细胞术分别检测脾细胞上清以及细胞内的细胞因子水平;末次免疫2 w后,最佳Cps感染剂量滴鼻感染BALB/c小鼠,检测肺组织Cps载量、肺上清炎症因子水平以及病理损伤情况,并通过qRT-PCR检测不同组织中Cps的含量。6.基于CNPs以及HBc-144构建CNPs/HBc-144新型疫苗佐剂,通过理化性质检测分析新型佐剂的及稳定性以形态结构。随后将CNPs/HBc-144与融合抗原结合后连续免疫7 d,并监测BALB/c小鼠的体重变化。免疫7 d后,处死BALB/c小鼠,取肺组织以及注射部位肌肉组织进行H&E染色。7.CNPs/HBc-144-Ags联合免疫BALB/c小鼠4次,间隔2w。分别收集每次免疫BALB/c小鼠的血清、鼻腔灌洗液以及生殖道灌洗液,检测血清IgG、IgA以及sIgA抗体水平;流式细胞术检测细胞内CD4+、CD8+细胞水平以及CD44/CD62分泌水平,并检测细胞上清以及细胞内细胞因子水平;随后进一步检测感染BALB/c小鼠的肺组织Cps载量、肺上清炎症因子水平以及病理损伤情况。最后通过qRT-PCR检测心、肝、脾等组织中的Cps载量。结果:1.通过 DNAStar 以及 IEBD 预测分析,MOMP 的第 24-32、86-100、262-272、328-340 位以及 CPSIT_p6 蛋白的第 15-25、109-119、173-181、280-290位为潜在的抗原表位片段。而其中MOMP第24-32、262-272 位以及 CPSIT_p6 蛋白第 109-119、173-181 位含有潜在T细胞位点且抗原指数较高。2.MOMP24-32、MOMP262-272、CPSIT_p6109-119、CPSIT_p6173-181 多肽片段均能在免疫BALB/c小鼠体内诱导产生较高的血清IgG、IgA水平;此外,各多肽片段还能够显著刺激免疫BALB/c小鼠脾细胞增殖,诱导脾细胞上清中Th1型细胞因子IFN-γ的分泌。3.多表位融合抗原免疫BALB/c小鼠后,其血清IgG、IgM、IgA以及IgG亚类抗体水平均显著高于阴性对照组,细胞上清IFN-γ、IL-2的分泌水平也平显著上升。此外,Cps感染后,融合抗原免疫BALB/c小鼠的肺组织衣原体包涵体滴度以及肺组织上清中IFN-γ、IL-6分泌水平均显著低于阴性对照组,且肺组织炎性浸润程度较轻。4.过继转移消耗CD8+细胞的抗原特异性脾细胞能够显著降低BALB/c小鼠肺组织中Cps载量。而过继转移消耗CD4+细胞的融合抗原特异性脾细胞较PBS以及FA过继转移组并无显著差异。5.滴鼻、肌肉联合免疫组血清IgG以sIgA水平均显著高于对照组;联合免疫能够有效刺激免疫BALB/c小鼠脾细胞的增殖,且脾细胞上清中IFN-γ、IL-2、TNF-α以及IL-17A分泌水平也显著高于单独免疫组;此外,联合免疫组BALB/c小鼠的肺组织Cps载量以及肺上清中IFN-γ、TNF-α IL-6水平较对照组均显著降低,且血液、肝脏、脾脏等组织中Cps含量均显著低于对照组。6.经理化检测分析,CNPs/HBc-144-Ags为大小相似的圆形颗粒结构,且分布均匀。颗粒平均粒径181.6±41.2 nm,Zeta电位+6.62±0.23 mV,多分散指数 0.391±0.083;而 CNPs/HBc-144-Ags 连续免疫7 d后,BALB/c小鼠体重平稳,并未出现体重减轻。此外,病理检测结果显示,注射部位肌肉以及肺组织结构完好,并未出现严重的炎性浸润。7.CNPs/HBc-144-Ags在免疫BALB/c小鼠体内诱导产生的血清IgG、IgA水平均随免疫次数增加显著上升,但较CNPs-Ags以及HBc-144-Ags对照组并无显著差异,而CNPs/HBc-144-Ags诱导的sIgA则显著高于对照组。CNPs/HBc-144-Ags免疫BALB/c小鼠脾细胞上清中IFN-γ、IL-2以及IL-17A分泌水平均显著上升,且细胞内IFN-γ水平也显著高于对照组。此外,CNPs/HBc-144-Ags组BALB/c小鼠脾细胞中CD44/CD62的分泌水平要显著高于对照组。CNPs/HBc-144-Ags能够有效降低Cps感染后BALB/c小鼠肺组织衣原体载量、减轻肺组织的炎性病理损伤,并有效减少Cps在肝、脾、肾等组织中的含量。结论:1.MOMP24-32、MOMP262-272、CPSIT_p6109-119、CPSIT_p6173-181 为 Cps MOMP以及CPSIT_p6蛋白的优势抗原表位片段,具有良好的免疫原性,能够诱导产生体液免疫以及细胞免疫应答。2.基于Cps MOMP以及CPSIT_p6构建的多表位融合抗原能够诱导产生较强的体液免疫以及细胞免疫应答,有效抵抗小鼠Cps肺组织感染;多表位融合抗原诱导产生的细胞免疫应答可能主要由CD4+细胞介导。3.滴鼻、肌肉联合免疫能够增强Cps多表位融合抗原诱导的黏膜、体液免疫以及细胞免疫应答,并有效增强抗Cps感染免疫保护作用,抑制Cps感染后在BALB/c小鼠体内的扩散;4.CNPs/HBc-144新型疫苗佐剂能显著增强Cps多表位融合抗原诱导的黏膜免疫以及细胞免疫应答,同时促进记忆性T细胞分泌,形成记忆性免疫应答抵抗Cps体内感染。