天然产物是新药发现的源泉,而微生物来源的次级代谢产物又是天然产物最重要的来源之一。微生物次级代谢产物的合成基因通常成簇排列在基因组中,为其编码产物预测和生物合成研究提供了便利。随着基因测序技术的发展和基因分析方法的成熟,人们发现许多放线菌,特别是链霉菌中存在丰富的次级代谢产物合成基因簇,然而仅有一小部分可以与已知代谢物相关联,更多的是功能未知的隐性基因簇,显示了链霉菌巨大的新天然产物合成潜力。本研究论文主要通过基因序列指导的天然产物发现策略,尝试激活两条沉默次级代谢基因簇,从而获得新活性天然产物。具体包括：1) Streptomyces sp. LC6中一个五酮安莎基因簇的激活及其合成功能探究；2) Streptomyces sp. LZ35中一个NRPS-FAS杂合基因簇的激活及其异源表达。安莎霉素是一类以3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)为起始单元的I型聚酮类天然产物,主要分布在放线菌中,具有广泛强效的生物活性。Streptomyces sp. LC6是从厦门红树林植物秋茄中分离得到的一株AHBA合酶基因阳性菌,前期研究表明其基因组中包含一个新型五酮安莎霉素合成基因簇(jlm),但在实验室培养条件下未能从中分到相应的安莎类化合物,提示该基因簇可能处于沉默或低表达状态。本课题对该基因簇开展了以下研究：1)在Streptomyces sp. LC6中分别组成型表达该安莎基因簇中可能的正调控基因。本课题组张娟利同学从SARP组成型表达突变菌株中,分离获得了一类具有新颖骨架的五酮型安莎霉素二聚物juanlimycins。 2)通过基因敲除和代谢谱比较确证了jlm基因簇负责编码juanlimycins。 Jlm包括一套完整的AHBA合成基因(jlmGHIKLMN)、PKS基因(jlmABC)、酰胺合酶基因(jlmD)和其它多个与调控和后修饰相关的基因。3)为了探究juanlimycins的二聚化机制,我们将jlm的核心基因(jlm A-E)在AHBA前体供应丰富的Streptomyces sp. LZ35中进行了异源表达。HPLC检测显示异源表达突变株有明显的代谢差异峰出现,但LC-MS检测结果显示该差异峰分子量远小于juanlimycins和五酮单体,由于该差异峰产量太低,尚未能鉴定其结构。Streptomyces sp. LZ35是一株海洋放线菌,其基因组中存在一个隐性NRPS-FAS杂合基因簇has。本课题从调控基因组成型表达调控基因和异源表达两方面尝试获得该基因簇编码的新脂肽类化合物：1)在Streptomyces sp. LZ35中组成型表达has基因簇中分属IclR和LuxR家族的正调控基因。IclR家族调控基因组成型表达突变株能使培养基变为明显的浅绿色,HPLC代谢谱比较发现有明显差异峰,但产物追踪分离和结构鉴定显示差异峰为分支酸降解产物和离子螯合剂,并非预期的脂肽类化合物。LuxR家族调控基因组成型表达突变株的代谢谱与野生型有显著差异,差异峰与后期通过其它策略获得的脂氨基酸类化合物一致。2)对has基因簇的核心部分进行了DNA拼接(52.4 kb),但是拼接后的has基因簇导入异源宿主Streptomyces lividans SBT5后,未检测到异源表达产物。综上所述,本论文通过基因组挖掘策略成功激活了链霉菌LC6中的沉默的新型五酮安莎霉素合成基因簇和链霉菌LZ35中沉默的脂氨基酸合成基因簇,证明了操纵调控基因表达是简单有效的隐性基因簇激活手段,一方面为基因序列指导下的天然产物分离提供了例证,另一方面显示了链霉菌巨大的新天然产物挖掘潜力,为以后人们从隐性基因簇中获得新天然产物提供了借鉴。同时,我们也应该清楚地认识到,目前已有的基于基因序列的天然产物挖掘策略都或多或少存在“致命”缺陷,因此,要有效实现“定向的”天然产物发现,还需要综合使用多种手段并开发更通用且有效的挖掘工具。