研究背景脑中风是导致全球人类死亡的主要疾病,是第三大致死病因仅次于心脏病和癌症。同时,50%-70%存活者具有严重的后遗症,包括瘫痪,失语等。其中缺血性脑中风是脑中风的主要类型,发病率约占脑卒中的80%,具有发病率高、致残率高、复发率高、死亡率高等特点,给家庭和社会带来沉重的负担。临床上尽快恢复脑损伤后的血液供应,挽救濒临死亡的脑细胞是减轻脑缺血后脑损伤的关键。目前,在急性脑缺血早期静脉注射重组组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是唯一被美国食品药品监督管理局(FDA)批准的溶栓治疗手段。但是由于其存在很窄的治疗窗以及血液再灌注诱导的二次损伤,临床证明只有少部分患者从中获益。因此,研究药物保护血液再灌注诱导的二次损伤是近年来研究的热点。脑缺血再灌注损伤会激活一系列错综复杂的生理病理反应：氧化应激,钙超载,兴奋性氨基酸,炎症,细胞凋亡等,最终导致细胞死亡。其中氧化应激和细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤中扮演及其重要的角色。在动物实验中,已知多种药物可作用于该复杂的病理过程,对脑缺血再灌注具有一定的保护作用。①抗氧化剂：这类药物可清除由再灌注诱导的过量的自由基,改善氧化应激,证实对脑缺血再灌注有保护作用,如依达拉奉目前广泛应用于治疗急性缺血性脑卒中。②抗生素：研究人员发现四环素类药物通过减弱细胞免疫性以及阻断细胞凋亡级联反应保护脑卒中。③生长因子：生长因子通过抗凋亡和抗炎作用减轻脑卒中后的损伤,而且可促进神经和血管再生,如脑源性神经营养因子(BDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等。④钙离子通道抑制剂：通过提高Na+-K+-ATP酶的活性,维持细胞膜的正常功能,保证脑内离子稳定,防止缺血再灌注后脑细胞内Ca2+超载造成的损坏,从而发挥保护作用。实验研究证明尼莫地平对急性脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。⑤抗炎症药物：炎症是脑缺血再灌注损伤中主要的病理特征,抗炎药物通过抑制中性粒细胞浸润和降低黏附分子的表达而抑制炎症过程,保护脑组织。实验研究证明高剂量抗炎药物布洛芬可以干扰白细胞和内皮细胞之间相互作用,通过抑制内皮细胞黏附分子的表达产生抗脑损伤作用。⑥中药：中药对缺血性脑卒中的显著临床疗效使其成为神经保护药物的重要研究对象,越来越多的证据表明中药对脑缺血具有保护作用。川芎嗪、灯盏花注射液、银杏叶制剂、丹参注射液、红景天等药物从不同途径、不同环节对缺血性脑卒中病人起到一定的脑保护作用。α-硫辛酸(LA)是一种存在于线粒体的酶,属于硫醇类化合物,具有很强的抗氧化性。LA既水溶性也脂溶性,很容易分布到机体内各个组织中,被称为“万能抗氧化剂”,是人类不可或缺的抗氧化剂。在体内LA转化为二氢硫辛酸(DHLA),两者都具有很强的抗氧化性。LA具有多种生物活性：清除自由基,再生其他抗氧化剂,抗炎,抗凋亡,螯合金属离子等。LA现在临床主要应用于糖尿病周围神经病变,但是国内外学者发现LA对多种疾病具有潜在的治疗价值,如糖尿病肾病,阿尔茨海默病,帕金森综合症,缺血再灌注,衰老以及重金属中毒等。实验证明LA对多种组织缺血再灌注具有保护作用,包括心脏、周围神经、睾丸、视网膜以及大脑等。过去有关研究表明LA治疗心肌组织缺血再灌注损伤是通过激活PI3K/Akt和ERK1/2信号通路,这两个信号通路对于促进细胞增殖、分化以及凋亡起着关键性作用。但是,据我们所知很少研究涉及LA对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用及其作用机制。所以本文研究了LA在大鼠脑缺血再灌注模型中保护大脑功能的药效学及其作用机制。目的本实验采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型,研究LA对大鼠脑缺血再灌注的药效作用,同时对其作用机理进行初步探讨。方法1.建立SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型大鼠术前禁食12小时但不禁水。用10%水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉,用75%乙醇消毒大鼠颈部皮肤,在颈部正中切开皮肤,剪开前筋膜,钝性分离胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌之间的间隙,分离左侧颈总动脉(CCA)和迷走神经。往远心端找出并分离颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。临时结扎CCA,动脉夹夹闭左侧ICA,结扎并切断左侧ECA,下拉近心端,与左侧ICA呈直线。然后在ECA近分叉处用眼科剪45。剪一小斜口由此插入制备好的线栓,松开动脉夹,缓慢向ICA插入线栓,直到推进至分叉处18-20mm遇阻力即止。松开CCA,缝合皮肤。阻断血流90分钟后,拔出线栓实现再灌注。整个手术期间用台灯保证大鼠体温为37℃。再灌注24小时之后,采用Longa评分法对大鼠神经功能进行评分：0分：正常；1分：脑缺血对侧前肢不能完全伸展；2分：实验动物向缺血对侧转圈；3分：实验动物爬行时向缺血对侧倾倒；4分：实验动物不能自发行走,意识丧失。2.LA对大鼠脑缺血再灌注治疗作用的初步药效学研究大鼠随机分为假手术组(Sham)(n=12),模型组(I/R)(n=12), LA低剂量组(L-LA)(n=6),LA中剂量组(M-LA)(n=6),LA高剂量组(H-LA)(n=12)。假手术组：不插入线栓,其他操作与其他组别一样；模型组：大脑中动脉阻塞前2小时皮下注射等量生理盐水；LA低剂量组：大脑中动脉阻塞前2小时皮下注射50mg/kg LA;LA中剂量组：大脑中动脉阻塞前2小时皮下注射70mg/kg LA; LA高剂量组：大脑中动脉阻塞前2小时皮下注射100mg/kg LA。LA粉末混悬于生理盐水,然后加入1M NaOH溶液,待LA完全溶解之后,用稀盐酸调节溶液pH值为7.4,过0.22μm滤膜。大鼠再灌注24小时之后,用Longa评分法对大鼠神经功能进行评分。用10%水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉并处死大鼠,通过TTC染色观察各组大鼠脑缺血再灌注之后梗死范围以及测量其梗死面积,用干湿法测量脑缺血侧大脑水含量,并使用尼氏染色观察海马CA1区神经元形态完整性。3.LA对大鼠脑缺血再灌注诱导损伤治疗作用的机制研究大鼠随机分为假手术组(Sham);模型组(I/R)：大脑中动脉阻塞前2小时皮下注射等量生理盐水；LA给药组(LA)：大脑中动脉阻塞前2小时皮下注射100mg/kg LA;每组6只。大鼠缺血90分钟再灌注24小时之后麻醉并处死,测定大脑组织相关的氧化指标：丙二醛(MDA),一氧化氮(NO),过氧化物歧化酶(SOD),总抗氧化能力(T-AOC)。同时,利用western blot方法检测脑组织Cleaved caspase-3、脑源性神经营养因子(BDNF)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化苏氨酸／丝氨酸蛋白激酶(Akt)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)蛋白在各组大鼠大脑组织中的表达情况。结果1.LA对大鼠脑缺血再灌注神经保护治疗作用的初步研究大鼠脑缺血90分钟再灌注24小时后,发现假手术组,模型组和给药组,在神经功能活动上有不同的表现。模型组大鼠神经功能评分明显增高,与假手术组比较差异具有显著性(P<0.05)；与模型组比较,LA高剂量组显著降低神经功能评分(P<0.05),LA低剂量组和中剂量组没有明显改变(P>0.05)。与模型组比较,LA高剂量组的脑梗死面积明显减少(P<0.05)；LA低剂量组和中剂量组与模型组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。脑缺血再灌注可以诱导大脑含水量明显升高,导致大鼠脑水肿,100mg/kg LA能够明显降低大鼠脑含水量(P<0.05),增加海马CA1区尼氏阳性神经元细胞。2.LA对大鼠脑缺血再灌注治疗作用的机制研究与假手术组比较,模型组大鼠脑组织的MDA和NO含量显著升高(P<0.05),但是SOD以及T-AOC活性明显下降(P<0.05),LA能够降低脑组织中的MDA和NO的含量以及提高SOD和T-AOC的活性,差异具有显著性(P<0.05)。与模型组比较,LA组的Cleaved caspase-3蛋白表达显著下降(P<0.05)；与模型组比较,LA组的BDNF蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较,LA组的PI3K蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较,LA组的p-Akt蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较,LA高剂量组的p-ERK1/2蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论1.LA可以改善大鼠神经功能缺损,减少脑梗死面积以及减轻脑水肿,增加海马CAl区尼氏染色阳性神经元细胞,提示对脑缺血再灌注具有一定的保护作用。2.LA能够降低脑组织中MDA和NO含量,增强SOD和T-AOC活性,从而改善由脑缺血再灌注诱导的氧化应激水平,提高脑细胞的抗氧化能力；同时LA能够降低Cleaved caspase-3蛋白的表达,抑制Caspase依赖的细胞凋亡。3.LA的神经保护作用可能是通过增加脑组织中BDNF蛋白表达水平,进一步激活PI3K/Akt以及ERK1/2信号通路。