论文部分内容阅读
目的:精神分裂症是一种以情绪损害、认知缺陷和社交功能障碍为特征的慢性、致残性精神疾病。精神分裂在全世界影响已经超过2000万人,给家庭和社会带来了沉重的负担。此外,精神分裂症也是法医精神病领域鉴定的重要内容,但目前其鉴定缺乏客观的指标。因此精神分裂症病因及发病机制的研究受到越来越多的关注。精神分裂症受到遗传因素和环境因素的共同影响,其病因复杂,研究显示遗传因素在精神分裂症的易感性以及病程发展过程中扮演十分重要的角色。精神分裂症的病因及发病机制涉及多种神经递质系统的假说,涉及的神经递质包括谷氨酸、多巴胺、五羟色胺及γ-氨基丁酸。其中,谷氨酸是人类中枢神经系统重要的兴奋性神经递质,通过与受体结合发挥生物学作用。谷氨酸受体分为4大类18种亚型,其中NR1受体由于在大脑中被普遍转录而受到了最为广泛的关注。NR1受体由GRIN1基因编码,被报道与抑郁症、多动症、阿尔茨海默症、帕金森等多种神经精神疾病相关。然而,目前对于GRIN1基因与精神分裂症的关联性研究结果并没有统一,中国北方汉族人群的数据较为缺乏,并且对人类GRIN1基因的表达具有调控作用的基因区域研究也相对不足。因此,本研究将对中国北方汉族群体GRIN1基因部分SNP的分布进行调查,探讨其与精神分裂症是否具有关联以及对法医物证学的应用价值。同时,将验证在GRIN1基因5’和3’端对基因表达有的影响的调控序列,为进一步的功能研究打下基础。研究方法:以316名中国北方汉族无关健康志愿者和309名中国北方汉族精神分裂症患者作为调查对象。对扩增的GRIN1基因5’端-2334bp～+86bp的片段进行Sanger DNA测序分析,应用Haploview 4.2软件对SNP的分布进行Hardy-Weinberg平衡检验,应用Powerstats v1.2软件对法医学参数进行计算。通过病例-对照研究探讨SNP的分布及其组成的单倍型与精神分裂症是否存在关联。应用基因克隆与基因重组技术,以5’端不同单倍型及5’和3’端不同长度DNA序列截断体为重组子,构建表达载体。转染不同细胞系后,利用双荧光素酶报告基因技术检测其相对荧光强度,以研究对GRIN1基因表达具有调控作用的功能序列。结果:本研究共检测到rs112421622、rs138961287、rs117783907、rs181682830、rs7032504、rs144123109和rs11146020等7个SNP位点。全部SNP位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。Rs138961287、rs117783907和rs11146020等3个SNP的等位基因频率分布相对较好,DP值在0.5左右。连锁分析结果显示rs138961287和rs117783907处于连锁不平衡状态,且rs11146020分别于rs138961287和rs117783907具有连锁不平衡关系。病例-对照研究结果显示rs138961287的Ins T等位基因、rs117783907的T等位基因和rs11146020的C等位基因在精神分裂症组（15.2%、15.2%和14.7%）和对照组（20.9%、21.7%和20.1%）之间的频率分布均存在显著性差异。7个SNP所形成的6种单倍型中,单倍型H1和H2在病例组（77.8%和12.6%）与对照组（70.9%和16.8%）之间的频率分布均存在显著性差异（p分别为0.005和0.046）。研究显示,重组单倍型载体H1和H2在HEK-293、SK-N-SH和U87细胞中的相对荧光强度不具有统计学差异（p分别为0.178、0.956和0.501）。截断体重组载体F10和F11在3种细胞系间的相对荧光强度均具有显著性差异（p分别为0.036、4.091E-06和1.606E-06）。此外,在SK-N-SH和U87细胞中,重组表达载体F10和F12的相对荧光强度分别相较于F9和F11呈显著上升趋势（p分别为0.003和3.086E-06）。在GRIN1基因3’UTR区,完整的重组表达载体F1在HEK-293、SK-N-SH和U87细胞系中的相对荧光强度与pmir GLO-Basic载体相比均显着降低（p分别为0.002、6.321E-26和3.390E-14）,重组表达载体F6的相对荧光强度相较于F5显着升高（p分别为0.004、3.294E-06和3.294E-06）。此外,在SK-N-SH细胞中,F4和F7的相对荧光强度分别相较于F3和F6显著性下降（p分别为4.711E-05和8.413E-05）。生物信息学分析提示has-mi R-212-5p、has-mi R-324-3和has-mi R-326可能识别F6-F7之间的功能序列,而has-mir-491-5p可能识别F3-F4之间的功能序列。F1分别与has-mi R-212-5p mimic、has-mi R-324-3 mimic、has-mi R-326 mimic、has-mir-491-5p mimic和对照mi RNA NC mimic共转染,F1再分别与has-mi R-212-5p inhibitor、has-mi R-324-3 inhibitor、has-mi R-326 inhibitor、has-mir-491-5p inhibitor和对照mi RNA NC inhibitor共转染的结果表明,在HEK-293、SK-N-SH细胞和U87中,F1+has-mi R-491-5p mimic的相对荧光强度较F1+mi RNA mimic NC显著下降（p分别为0.021、0.000267和0.029）。而F1+has-mi R-491-5p inhibitor的相对荧光强度与F1+mi RNA inhibitor NC的相比,在三个细胞系中相对荧光素酶表达的统计学差异均消失。结论:1.GRIN1基因rs117783907、rs138961287和rs11146020在中国北方汉族群体中的多态性分布较好,具有一定的法医学应用价值。2.在中国北方汉族群体中,GRIN1基因rs117783907的T、rs138961287的Ins T以及rs11146020的C等位基因在中国北方汉族群体中可能是精神分裂症发生的保护性因素。3.在中国北方汉族群体中,GRIN1基因5’端单倍型H1与H2可能与精神分裂症的易感性相关。4.GRIN1基因5’端单倍型H1与H2对基因的表达没有影响。5.在神经细胞中,GRIN1基因5’端-337bp～-159bp和-704bp～-556bp的片段中可能包含转录抑制序列,而-556bp～-337bp则可能包含转录增强序列,可为基因调控的机制研究提供参考。7.mi R-491-5p可以下调GRIN1基因在HEK-293、SK-N-SH和U87细胞系中的表达。