论文部分内容阅读
[目的]
建立PCR-RDB技术快速检测泌尿生殖道致病性支原体;用临床常用支原体检测方法结合其他分子生物学技术评价PCR-RDB技术;将PCR-RDB技术用于临床检测中,探讨不同人群中支原体感染情况。
[方法]
1采用巢式PCR方法扩增四种支原体:以16SrRNA基因为扩增靶序列设计通用引物及特异性探针;优化Up、Uu、Mg和Mh的PCR扩增方法。
2建立PCR-RDB技术检测四种支原体:PCR-RDB方法学建立;PCR-RDB方法学的优化。
3 PCR-RDB方法学评价:1)敏感性分析:通过Up、Uu和Mh固体培养物定量进行PCR-RDB检测的敏感性分析:采用DNA绝对含量测定进行PCR-RDB检测Mg的敏感性分析。2)特异性分析:在GeneBank中Blast分析探针的特异性;PCR-RDB检测标准菌株的特异性分析;PCR-RDB检测泌尿生殖道其它常见菌的特异性评价;PCR-RDB法、固/液体培养法及Mg-PCR技术检测临床标本结果的对比评价;用RFLP方法鉴定PCR-RDB检测混合感染样本。
4方法学的应用:将以上所建立的PCR-RDB方法应用于临床样本的检测中;探讨不同人群支原体感染状况。
[结果]
1选择16SrRNA基因为靶序列,设计出两对通用引物及各支原体特异性探针,在DNA Star5.0、DNA Club及GeneBank中经比对优化后应用。
2巢式PCR扩增出四种支原体的标准株,2％琼脂糖凝胶电泳均显示298bp清晰明亮条带。
3 PCR-RDB方法经优化试验显示,10mmol/L为探针浓度和42℃杂交温度杂交过夜显示较好的结果。
4 PCR-RDB方法检测Uu、Up和Mh的敏感性均为1cfu,检测Mg的敏感性为6.5pg/ul。
5 GeneBank Blast分析探针的特异性显示与泌尿生殖道其他常见病原体无交叉反应;PCR-RDB结果显示4种探针仅与相应支原体标准株产生特异性杂交。
6 PCR-RDB法检测60例临床拭子标本共检出支原体阳性19例,分别为Uu8例、Up6例、Mg1例、Mh1例、Up+Uu2例和Uu+Mg1例:固、液分离培养法检出17例,包括UUl6例(未分群),MH1例;特异性Mg-PCR扩增检出2株。采用Hinf1对PCR-RDB检出的Up/Uu进行RFLP分析,8例Uu经酶切后电泳显示DNA片段长度为78bp、220bp,6例Up未被酶切仍为298bp,2例Up+Uu样本均显示78bp、220bp、298bp三条带。
7用PCR-RDB方法检测390例临床拭子标本,包括性病门诊患者279例,女性性工作者111例,共检出149例支原体阳性标本。支原体总体感染率为38.2%,性病门诊患者、女性性工作者感染率分别为27.2%、68.5%;性病门诊女性患者感染率高于门诊男性(P＜0.01);女性性工作者感染率高于性病门诊女性(P＜0.01)。性病门诊患者以单一感染为主,女性性工作者多见混合感染,以Up+Mh、Up+Uu+Mh为主(P＜0.01)。同时发现Mg在性病门诊患者与女性性工作者的感染率分别为2.87%、7.21%。
[结论]
1 PCR-RDB技术能快速、敏感、准确检测和鉴别Up、Uu、Mg和Mh引起的单一感染和混合感染,对于临床NCNGU的鉴别诊断有重要意义。
2 PCR-RDB技术在致病性支原体诊断方面克服了培养方法的不足更具优势,与其他方法比较有好的一致性,值得临床推广应用。
3性病门诊患者与女性性工作者支原体感染有较大差异,加强致病性支原体感染的分子流行病学研究对于有效STD有重要意义。