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铝毒害是酸性土壤作物产量的主要限制因子,研究耐铝机制是解决酸性土壤铝毒害问题的前提和基础。钙离子是普遍存在的细胞内信号。细胞质中钙离子浓度的增加能够激活很多蛋白,包括钙调素和钙/钙调素依赖性蛋白钙调磷酸酶。钙调磷酸酶从酵母到人类都是保守的(除了植物),许多钙调磷酸酶的靶蛋白已经被鉴定。C2H2型转录因子存在于许多真菌、变形虫和低等真核生物中。Crz1转录因子是响应钙调磷酸酶调控的C2H2型转录因子。已有研究表明钙调磷酸酶/Crz1信号的功能,包括细胞内离子平衡,细胞壁纤维的形成,并在各生物中是保守的。钙调磷酸酶的激活可使多个基因表达上调,而这些基因在△crz1中的表达量都会降低,这表明Crz1转录因子是通过钙调磷酸酶的介导来调控基因表达的。C2H2型转录因子Asr1存在于土生隐球酵母中。为了进一步验证钙调磷酸酶及转录因子Asr1在酵母抗铝中作用机制,本研究利用土生隐球酵母为实验材料得到如下结果:在铝胁迫浓度梯度和时间梯度下,对土生隐球酵母钙调磷酸酶通路基因:Calmodulin(cam)、Calcineurin catalytic subunit A(cna);C2H2型转录因子 Asr1基因和细胞壁组分合成酶相关基因:endo-1,3(4)-beta-glucanase(1-G5)、chitin synthase(2-E5)、chitin deacetylase-like mannoprotein(7-C12)、capsular associated protein(7-C10)进行荧光定量PCR,在分子水平上分析铝胁迫下基因表达情况。结果显示铝胁迫促进了钙调磷酸酶通路上cam、cna基因;asr1编码基因和细胞壁组分合成酶相关基因的表达。构建了 Asr1原核表达载体并利用大肠杆菌原核表达系统,低温诱导得到了 Asr1蛋白并对其进行纯化。构建了 Asr1酿酒酵母表达载体,研究表明转基因酵母在5 mM铝离子含量平板上长势相对较好,但转空载和对照酵母生长却受到抑制。通过测定培养基中剩余铝含量,得出转基因酵母相比较转空载和对照酵母具有较强的吸附铝能力。用同源重组法对土生隐球酵母asr1基因进行敲除,将突变体、野生型和asr1回复突变菌株进行平板抗铝鉴定,结果表明在200 mM铝的平板上野生型和回复突变型长势较好,但△asr1菌株的生长受到了抑制。通过测定培养基中剩余铝含量表明,△asr1菌株的吸附铝能力受到了明显影响。