从天然组织构建通用型脱细胞组织工程支架的研究

来源 :浙江工业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lidandanlidd12141
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天然的细胞外基质和人工合成的细胞外基质材料都是组织损伤与修复中的重要成分,在生物医学工程领域具有广泛的应用前景。天然的脱细胞支架提供了天然的三维结构和优良的物理机械特性,并具有良好的生物相容性。然而,由于天然组织在化学成分和三维结构上的复杂性,使得天然脱细胞支架的应用具有不确定性。本研究旨在通过对不同组织来源脱细胞支架的理化特性和生物相容性进行比较,探讨构建通用型组织工程支架的可行性,为组织工程研究提供新的思路。本实验首先选取小鼠肝、肺、脑组织作为制备脱细胞组织工程支架的材料来源,采用物理冻融循环并结合曲拉通X-100、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、Trypsin/EDTA一系列脱细胞试剂进行模式化脱细胞处理,同时制备脱细胞肝支架(DLIS)、脱细胞肺支架(DLUS)和脱细胞脑支架(DBRS)。然后,采用苏木素-伊红染色、DAPI荧光染色、Masson染色、爱先蓝-糖原染色对脱细胞支架的理化特性进行研究,以观察DLIS、DLUS、DBRS的细胞去除程度和支架组织形态;采用分光光度法检测脱细胞支架中的DNA、糖胺聚糖(GAG)和胶原蛋白的含量,以进一步研究脱细胞支架的化学组分。最后,对三种不同来源的脱细胞支架接种HepG2细胞(人肝癌细胞系)、A549细胞(人肺癌细胞系)和SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞系)三种不同类型的细胞系,采用CCK-8法检测这三种细胞在不同组织支架中的生长增殖情况,以探究脱细胞支架的生物相容性。研究结果发现:(1)脱细胞支架制备的有效性:经过上述模式化的脱细胞处理,小鼠肝、肺、脑组织都发生了颜色由深向浅,质地由致密向疏松的转变,最终成为乳白色半透明结构。对脱细胞处理后的组织进行形态结构学分析,苏木素-伊红染色显示三种组织都很少见到染成紫红色的细胞核,DAPI荧光染色显示少有荧光素着色的细胞核。对细胞核DNA进行定性定量分析,琼脂糖电泳显示三种处理后组织均未见明显的DNA条带,荧光定量法检测在三种处理后组织仅测出痕迹量DNA,DNA去除率达到98.1%-99.7%。由此可知,经本实验模式化的脱细胞处理后,三种组织都已有效地去除了细胞成分。(2)脱细胞支架的形态结构与化学组分:Masson染色和爱先蓝-糖原染色显示,三种组织在脱细胞处理后,其细胞外基质中的胶原蛋白和GAG成分均有较多的保留,其三维支架结构仍能保持基本完整。定量检测结果发现,脱细胞处理后,胶原蛋白在DLIS中保留了53.11%、在DLUS中保留了63.67%、在DBRS中保留了57.24%。按脱细胞支架的组织干重计算,DLIS中胶原蛋白的相对比值为37.1±9.48μg/mg,DLUS中胶原蛋白的相对比值为134.21±19.16μg/mg,DBRS中胶原蛋白的相对比值为55.54±10.22μg/mg。GAG在DLIS中保留了35.75%、在DLUS中保留了31.20%,而在DBRS中只保留了15.34%。按脱细胞支架的组织干重计算,DLIS中GAG的相对比值为5.85±0.92μg/mg,DLUS中GAG的相对比值为3.44±0.95μg/mg,而DBRS中GAG的相对比值为4.57±0.90μg/mg。以上结果表明,经本实验模式化的脱细胞处理所制备的三种脱细胞支架,均保留了良好的三维多孔状结构,并且三种脱细胞支架中胶原蛋白和GAG均有较好的保留。(3)脱细胞支架的细胞相容性:对DLIS、DLUS和DBRS分别接种HepG2细胞、A549细胞和SH-SY5Y细胞三种不同系列的细胞系,其在三种脱细胞支架中均能够存活。采用CCK-8法对细胞活力的检测结果发现,在7天的培养期中,每种细胞都表现出活力逐渐增强的增殖现象,并且在脱细胞支架中生长的细胞比普通平面培养的细胞更有活力。另一方面,三种脱细胞支架分别与不同细胞的共培养结果具有相似性和交叉性,即DLIS能同时促进HepG2细胞、A549细胞和SH-SY5Y细胞的生长,DLUS和DBRS也都可同时促进这三种细胞的生长。这些结果表明,这三种不同种类的脱细胞支架,其细胞相容性具有交叉互用性的特点。本研究采用不同的天然组织成功制备了三种脱细胞支架,通过检测和比较这三种脱细胞支架的结构和化学组成,发现它们的化学组成和形态结构本质上具备相似性。细胞相容性研究则证实,这三种脱细胞支架对不同来源细胞的接纳程度具有通用性,这揭示了制备各种组织细胞都能适用的通用型组织工程支架是有技术可行性的。
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