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研究背景及目的胶质瘤(Glioma)是源于神经上皮的原发性脑肿瘤,占颅脑恶性肿瘤的81%,死亡率较高。恶性程度最高的胶质瘤如胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)占中枢神经系统恶性肿瘤的46.6%。成人GBM的发生率随年龄的增长而增加,诊断中位年龄为64岁,中位生存期只有14个月,5年生存率为5.5%。阐明胶质瘤的病理生理机制已成为治疗胶质瘤亟待解决的问题。线粒体相关内质网膜(Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)是内质网(Endoplasmic reticulum,ER)与线粒体接触形成的动态结构平台。它不仅是内质网和线粒体之间的桥梁,还负责两个细胞器之间的通讯连接,诸如脂质的合成和转运,线粒体功能的调节,自噬体的形成,Ca2+稳态的调节和细胞凋亡等。在内质网应激、缺氧或短期营养缺乏条件下,内质网和线粒体之间的距离越来越近。另外,在自噬,细胞凋亡和线粒体代谢改变的情况下,MAMs的超微结构会发生改变。此外,MAMs上能够招募很多癌蛋白或抑癌蛋白,通过调节这些蛋白的活性、彼此之间的互作、死亡信号通路和氧化还原信号影响肿瘤的发生与发展过程。高迁移率族蛋白1(High mobility group box 1,HMGB1)是存在于真核细胞内的一类核蛋白,主要参与DNA的修复。HMGB1在大多数肿瘤中的表达均上调,胶质瘤中也有相应的报道。目前已有一些针对HMGB1治疗肿瘤的策略被提出,主要是通过直接或者间接手段抑制HMGB1的表达、活性以及转移等过程。研究显示:在病理情况下,释放入胞质中的HMGB1可定位到线粒体上,使线粒体变长,导致“巨型”线粒体的形成,mtDNA的耗竭以及线粒体蛋白质的严重破坏;参与线粒体的结构重塑过程。HMGB1还可以调节线粒体的功能和形态。这些研究表明:HMGB1与线粒体之间的关系非常密切。胞质型HMGB1还可以通过与Beclin1或p53的结合,调控自噬过程。MAMs是自噬体装配的起点,一些蛋白如ATG15、ATG5、Beclin1、p53均定位在MAMs上参与自噬的发生。这些研究提示:HMGB1可能定位在MAMs上参与自噬。研究发现:Sigma-1受体(Sigma1-R)是MAMs的驻留蛋白。Sigma1-R可调控背根神经节中HMGB1的表达。可卡因通过Sigma1-R介导的途径诱导星形胶质细胞发生自噬,自噬信号蛋白p-mTOR,Atg5,Atg7和p-Bcl-2/Beclin-1也参与其中。这些研究提示:HMGB1与Sigma1-R可能存在联系。综上所述,MAMs上能够招募许多蛋白调控细胞的一系列功能,而目前的研究表明胞质型HMGB1与线粒体存在密切联系,且有可能定位在MAMs上,并且MAMs上的蛋白Sigma1-R能调控HMGB1的表达,因此我们推测胞质型HMGB1可能定位在MAMs上发挥功能。因此,本研究从胶质瘤着手,探索了HMGB1的亚细胞定位与MAMs的相关性。研究内容分为三个部分:第一部分,我们采用免疫荧光,免疫组化检测胶质瘤细胞和组织中MAMs的变化,发现胶质瘤中MAMs增多。然后我们统计分析了 CGGA和TCGA数据库中三磷酸肌醇受体 3(inositol 1,4,5-triphosphate receptor type 3,IP3R3)的表达量来定量分析MAMs的变化,结果显示高级别胶质瘤中IP3R3的mRNA表达水平高于低级别胶质瘤;第二部分,我们通过免疫组化、免疫荧光、核质蛋白分离、亚细胞分级分离、蛋白质印记和免疫电镜等方法,发现胶质瘤中胞质型HMGB1在MAMs上存在定位;第三部分,我们通过核质蛋白分离和生物信息学等技术,发现HMGB1的胞质转移受MAMs驻留蛋白Sigma1-R的调控。本研究从HMGB1与MAMs的相关性着手探讨胶质瘤的病理生理机制,以期为胶质瘤的治疗提供新的理论依据。材料和方法第一部分:胶质瘤中的MAMs的变化1.分别对正常星形胶质细胞系(HA1800)和胶质瘤细胞系(U251、U87-MG、U118-MG)进行线粒体和ER的免疫荧光染色,通过激光共聚焦显微镜观察MAMs的改变。2.对正常脑组织和胶质瘤组织进行线粒体和ER免疫组化染色,通过激光共聚焦显微镜观察MAMs的改变。3.下载CGGA、TCGA中的胶质瘤数据,统计分析IP3R3的基因表达水平以检测MAMs的变化情况。第二部分:用H2O2或通过饥饿(HBSS)刺激胶质瘤细胞U87-MG,检测胞质型HMGB1的亚细胞定位1.通过免疫组化染色检测胶质瘤组织中HMGB1的定位。2.通过H2O2或饥饿(HBSS)刺激U87-MG细胞,检测HMGB1的胞质转移。3.使用ATP5A标记线粒体并且与HMGB1免疫荧光双标,检测胶质瘤组织中HMGB1与线粒体的共定位。通过H2O2或饥饿(HBSS)刺激U87-MG细胞,使用Mitotracker Red标记线粒体并且与HMGB1免疫荧光双标记,检测胞质型HMGB1与线粒体的共定位。4.给U87-MG细胞转染HMGB1-EGFP质粒,并给予U87-MG饥饿(HBSS)刺激,用Mitotracker Red标记线粒体,检测活细胞中胞质型HMGB1-EGFP在线粒体上的定位。5.在胶质瘤组织中,用ATP5A标记线粒体,CANX标记内质网,检测HMGB1与线粒体、内质网的共定位。给U87-MG细胞饥饿(HBSS)刺激,用Mitotracker Red标记线粒体,CANX标记ER,检测HMGB1与线粒体、ER的共定位。6.给U87-MG细胞转染HMGB1-EGFP质粒,并同时给予饥饿(HBSS)刺激,用Mitotracker Red标记线粒体,用ER-Tracker Blue标记ER,检测活细胞中胞质型HMGB1-EGFP与线粒体、ER的共定位。7.分别对饥饿(HBSS)刺激过的U87-MG和U118-MG及胶质瘤组织进行亚细胞组分分级分离,检测提取的MAMs中是否存在HMGB1。8.饥饿(HBSS)刺激U87-MG后,免疫电镜检测HMGB1的定位。第三部分:饥饿(HBSS)刺激胶质瘤细胞U87-MG,检测MAMs的驻留蛋白Sigma1-R对HMGB1胞质转移的调节1.饥饿(HBSS)刺激U87-MG细胞,检测HMGB1和Sigma1-R的表达变化。2.下载GEO-GSE4290数据库中胶质瘤数据,统计分析HMGB1和Sigma1-R的表达情况及二者表达的相关性。3.饥饿(HBSS)刺激U87-MG细胞,分别使用Sigma1-R拮抗剂BD-1047和Sigma1-R激动剂Dimemorfan作用于细胞,检测HMGB1和Sigma1-R的表达量及HMGB1的胞质转移。研究结果1.与正常星形胶质细胞HA1800相比,恶性程度较低的胶质瘤细胞U251中的MAMs无明显差异,而恶性程度较高的胶质瘤细胞U87-MG和U118-MG中的MAMs明显增多。2.与正常脑组织相比,胶质瘤组织中MAMs明显增多。3.统计分析CGGA、TCGA数据库中胶质瘤数据,与低级别胶质瘤相比,高级别胶质瘤中IP3R3的基因表达增加。4.胶质瘤组织中HMGB1在胞核、胞质和胞外均有分布。5.在胶质瘤组织中检测到HMGB1与线粒体的共定位。H2O2或饥饿(HBSS)刺激U87-MG,HMGB1的胞质分布明显增多,且胞质型HMGB1与线粒体也存在明显的共定位。6.H2O2或饥饿(HBSS)刺激U87-MG,细胞中HMGB1-EGFP与线粒体结合较为稳定。7.在胶质瘤组织和饥饿(HBSS)刺激的U87-MG细胞中均检测到HMGB1、线粒体、内质网三者存在共定位。8.对饥饿(HBSS)刺激的U87-MG和U118-MG和胶质瘤组织进行亚细胞组分分级分离,分离得到的MAMs中存在HMGB1。9.饥饿(HBSS)刺激U87-MG后,免疫电镜实验检测到MAMs中存在金颗粒标记的HMGB1。10.饥饿(HBSS)刺激U87-MG,HMGB1和Sigma1-R的表达无明显变化。11.统计分析GEO-GSE4290胶质瘤数据,与非肿瘤组织相比,胶质瘤中HMGB1和Sigma1-R基因表达增加,但胶质瘤各级别之间的表达均无统计学差异,且HMGB1和Sigma1-R的表达呈正相关。12.饥饿(HBSS)刺激 U87-MG 后,Sigma1-R 拮抗剂 BD-1047 促进 HMGB1和Sigma1-R的表达,但抑制了 HMGB1的胞质转移。相反,Sigma1-R激动剂Dimemorfan抑制了 HMGB1和Sigma1-R的表达,但促进了 HMGB1的胞质转移。结论1.胶质瘤中MAMs增多,且随着胶质瘤级别的增加而增加。2.H2O2或饥饿(HBSS)刺激U87-MG,HMGB1从胞核进入胞质,胞质型HMGB1可定位到MAMs上;HMGB1的胞质转移受到MAMs的驻留蛋白Sigma1-R的调节。