第一部分新型自组装双亲多肽水凝胶的合成目的：设计和合成促进细胞增殖和TGF-β粘附的自组装双亲多肽水凝胶,并检测其自组装形成凝胶后的超微结构。方法：合成的PRG和TB多肽粉剂分别溶解于去离子水中,终浓度为1%。然后再分别稀释成0.05%(m/v),分别取3ul的PRG,TB及两者等体积混合的多肽溶液。原子力显微镜检测多肽的超微结构。结果：成功合成PRG和TB双亲多肽分子,双亲多肽溶液PRG和TB混合自组装形成凝胶。原子力显微镜扫描提示：PRG/TB混合水凝胶的纳米纤维比PRG和TB要大,PRG,TB,PRG/TB纳米纤维的平均直径分别为(16.7±4.7nm),(18.0±1.3nm)和(28.3±5.6nm)。结论：双亲多肽PRG和TB可以混合自组装形成纳米级凝胶支架(PRG/TB),可以作为软骨组织工程的生物支架材料。第一1部分新骨性关节炎模型的研究目的：探讨通过注射MIA的方法建立一种能模拟自然病程引起的早,中期骨性关节炎模型,用以评价组织工程修复关节软骨的研究。方法：40只新西兰雄性大白兔子被随机分为三组。麻醉后,通过关节穿刺的方法,每组膝关节右侧注射100ul不同浓度的MIA(1mg/ml、3mg/ml和6mg/ml),左侧膝关节注射PBS作为对照组。分别于2周,4周和6周拍膝关节X线,并用墨汁染色比较大体形态,组织病理染色观察软骨组织的退变。结果：兔膝关节1mg/ml MIA注射组关节退变不明显,兔膝关节3mg/ml和6mg/ml MIA组病理染色评分和对照组比有统计学意义(P<0.05)。但6mg/ml MIA注射组关节退变严重。结论：通过注射3mg/ml MIA的兔膝关节可以在六周内达到类似轻,中度骨性关节炎的关节退变,为评价组织工程修复软骨退变提供一个新的骨性关节炎动物模型参考。第三部分慢病毒载体融合蛋白TGF-β3和多肽水凝胶对脂肪间充质干细胞的生物学影响目的：构建出具有靶向治疗功能的新型TGF-β3融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3,并通过慢病毒载体包装后转染脂肪间充质干细胞(ADSCs),两者培养在多肽水凝胶支架内,以验证其可行性与靶向特异性。方法：消化法分离得到兔ADSCs,通过流式法鉴定ADSCs表面抗原及特殊染色法鉴定ADSCs多向分化能力。通过基因重组方法将LAP, mTGF-p3和基质金属蛋白酶(MMP)的酶切位点PLGLWA分别插入到真核质粒表达载体GV287,得到重组TGF-P3融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3的质粒。用慢病毒载体包装质粒后转染ADSCs,并培养在PRG/TB多肽水凝胶内。CCK8法检测增殖细胞增殖,钙黄绿素/碘化丙啶法检测细胞在凝胶内部的存活,Elisa法检测MMP酶刺激后上清液中的mTGF-p3。结果：成功分离培养出ADSCs,并且ADSCs培养在PRG/TB混合多肽水凝胶内可以提高增殖。慢病毒载体及PRG/TB多肽水凝胶对ADSCs的毒副作用小,并且MMP酶存在时可激活重组TGF-3融合蛋白释放活性的TGF-β3。结论：成功构建出慢病毒载体包装的新型融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3,慢病毒载体包装的新型融合蛋白转染的ADSCs与PRG/TB多肽水凝胶一起具有靶向性修复软骨缺损的应用前景。第四部分LV-mTGF-p3转染的脂肪间充质干细胞在双亲多肽水凝胶内诱导成软骨细胞的研究目的：探讨功能性自组装PRG/TB水凝胶支架与慢病毒包装的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3转染的兔脂肪间充质干细胞(ADSCs)诱导成软骨的影响。方法：将慢病毒包装的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3转染第三代ADSCs后,与功能性PRG/TB水凝胶支架共同培养在软骨细胞诱导液中,并增加10ng/m)基质金属蛋白酶-1(MMP-1)促进融合蛋白LAP-MMP-mTGF-p3释放TGF-β3,促进ADSCs分化成软骨细胞。3天后用Western blot检测TGF-P3在ADSCs中的表达。ADSCs诱导分化成软骨细胞21天后,分别用Real-time PCR和Western blot检测软骨细胞特异性基因Aggrecan (ACAN),II型胶原(COL2A1)和SOX-9的mRNA和蛋白的表达。结果：慢病毒包装融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3转染ADSCs效率能达到90%以上。3天后转染慢病毒的ADSCs成功检测到TGF-β3的表达。与未转染融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3的ADSCs相比,转染组明显促进了ADSCs向软骨细胞分化。21天后转染组与未转染组相比,ACAN、COL2A1和SOX-9mRNA表达分别增加2.7,2.4和1.0倍,蛋白表达分别增加2.4,1.57和0.89倍。结论：成功构建的慢病毒包装融合蛋白LAP-MMP-mTGF-p3转染ADSCs可促进ADSCs分化成软骨细胞,具有很好的修复软骨缺损的应用前景。第五部分功能性自组装多肽水凝胶联合LV-mTGF-β3转染的ADSCs修复骨性关节炎的研究目的：进一步验证PRG/TB自组装多肽水凝胶支架联合LV-mTGF-β3转染的兔脂肪间充质干细胞(ADSCs)在体内修复软骨的能力。方法：将慢病毒包装的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3转染ADSCs后,与功能性PRG/TB自组装多肽水凝胶支架共同培养在软骨细胞诱导液中。21天后,在裸鼠背部分别种植不同组的ADSCs和多肽PRG/TB自组水凝胶混合物,观察多肽凝胶的毒副作用,4W后注射部位的组织用阿利新蓝染色和免疫组化染色检测成软骨的能力。新西兰大白兔用注射MIA方法完成骨性关节炎造模,然后每七天注射一次多肽水凝胶和慢病毒转染后的ADSCs混合物到骨性关节炎模型的膝关节,注射PBS作为试验对照组。8W后,组织染色观察多肽水凝胶联合重组TGF-p3蛋白转染的ADSCs修复关节的情况。结果：慢病毒包装的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3转染ADSCs组在裸鼠皮下生成的软骨组织外形要大于其他组,阿利新蓝染色和免疫组化染色阳性表达明显高于其余组。注射多肽水凝胶和慢病毒转染后的ADSCs混合物组的病理染色结果显示明显改善了兔膝关节OA中软骨组织的退化。结论：功能性自组装多肽水凝胶联合慢病毒包装的重组TGF-β3蛋白转染的ADSCs能够在体内生成软骨组织,并明显改善OA中软骨组织退化的情况,具有很好的修复软骨缺损的应用前景。