随着FDA或CFDA对生物药品安全性的监管日趋严格,抗体药物的质量分析和控制成为研究热点。电荷变异体由于能影响抗体的体内外效能,被定为关键质量属性之一,并被列入产品放行指标。然而目前对于抗体电荷异质性的理解并不深入,在抗体药物大规模生产过程中,电荷变异体的含量仍很难实现精准调控。前期在表达IgG1抗体的GS-CHO细胞摇管流加工艺开发过程中,发现抗体的酸性变异体含量为18.4%,是原研药(12.5%)的1.47倍。为了解决抗体酸性电荷变异体含量偏高的问题,本研究依据“质量源于设计”的理念,从糖型、二硫键还原降解、聚体和碎片化、糖化、天冬酰胺脱酰胺和二级结构等多个方面对酸性变异体和主峰进行全面的结构表征,明确酸性变异体产生的关键因素。首先运用一系列分析仪器和方法,发现抗体HC-T8 Asn84和HC-T35 Asn388脱酰胺、轻重链间二硫键还原降解以及多聚体的产生是酸性变异体形成的重要原因;末端的半乳糖基化修饰与酸性变异体含量之间存在相关性,但并不是导致酸性变异体形成的直接原因。其次,考察细胞培养工艺条件(过程操作参数和培养基组分)对酸性变异体含量的影响,为最终实现抗体酸性变异体含量的精准调控指明方向。结果发现,降低后期培养pH,酸性变异体含量显著降低,使用分子排阻色谱、非还原-毛细管凝胶电泳、肽指纹图谱和还原蛋白分子量等分析手段,解析其原因包括以下两点:(a)降低了 HC-T35 Asn388脱酰胺的亲核反应速率;(b)降低了轻重链间二硫键还原降解反应速率。采用无细胞抗体孵育实验,初步发现氨基酸和维生素对酸性变异体的形成起正效应,碳水化合物和金属离子对酸性变异体的形成无影响。通过单因素细胞实验,发现维生素V浓度(1×～50×)对抗体的酸性变异体含量无影响,而氨基酸C浓度(1×～40×)越高,酸性变异体含量越高。从培养上清的氧化还原电位和硫氧还蛋白、谷氧还蛋白的mRNA水平两方面考察氨基酸C对酸性变异体含量的影响机制,发现提高流加培养基中氨基酸C浓度,细胞培养上清液的氧化还原电位值下降,即还原态增强,非酶催化的抗体二硫键还原降解反应速率增大,导致抗体轻重链间的二硫键还原降解程度变大,最终使得抗体的酸性变异体含量上升。基于前面的研究结论,在2-L反应器中设计了一个控制低酸性变异体含量的细胞培养工艺,酸性变异体含量从优化前24.5%降低为14.5%,解决了表达IgG1抗体酸性变异体含量偏高的问题。本研究不仅可以在理论上加深对抗体酸性变异体的认识,而且还能为工业化生产低酸性变异体含量的抗体提供实际指导意义。