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黑曲霉(Aspetgillus niger)是一种模式真菌和重要的工业微生物。硫氧还原蛋白系统中包含硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)和硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase，TrxR)以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)，与谷胱甘肽系统共同构成细胞内的氧化还原系统。由于Trx体系可还原二硫键，如大肠杆菌(Escherichia coli)中的Trx体系可降低食物中二硫键引起的变应原反应。本研究首先克隆并鉴定了黑曲霉Trx体系中的硫氧还蛋白(AnTrx)和硫氧还蛋白还原酶(AnTrxR)基因，并对AnTrx的保守区域进行位点突变分析。在此基础上利用基因重叠延伸技术(SOE)，用两种不同的融合肽，将两个蛋白进行融合。并就融合表达的Trx体系和独立表达的Trx体系进行比较分析。最后，提取麦醇溶蛋白，并将Trx体系和麦醇溶蛋白进行孵育，分析其对麦醇溶蛋白中二硫键的还原情况。
AnTrx的克隆表达与保守位点突变首次从黑曲霉全基因组中克隆出黑曲霉硫氧还原蛋白基因AnTrx，并对其第33～37位保守区的活性位点实施定点突变C34S、C37S及C34S-C37S，获得相应的三个定点突变基因。将野生型AnTrx及其突变子分别在E.coli中诱导表达，比浊法测定纯化的各表达产物还原牛胰岛素α与β链之间二硫键的活性。结果表明，AnTrx的三个突变体都不表现明显的催化活性。当突变型与野生型AnTrx等量混合后，发现突变型AnTrx-C34S可显著提高野生型AnTrx的催化效率，而突变型AnTrx-C37S却无此作用。由此证明，AnTrx活性结构域的第37位Cys残基上的巯基能参与攻击硫氧还原蛋白和底物蛋白所形成的二硫键而释放被还原的底物蛋白，而第34位Cys残基同其它微生物的同一活性域一样参于硫氧化还蛋白与底物的结合。这一结果有助于认识真菌硫氧还蛋白第37位活性位点的作用。
AnTrxR的克隆表达和活性测定根据已公布的黑曲霉基因，首次克隆并鉴定了黑曲霉硫氧还蛋白还原酶AnTrx的基因并将其转入E.coli中表达并获得纯化产物。在NADPH的存在下，AnTrxR除了可以还原Trx之外，还可将二硫代硝基苯甲酸(DTNB)还原成2-硝基，5-硫代苯甲酸(TNB)的形式。利用分光光度计测定其在412 nm的吸收值，获得AnTrxR还原DTNB的酶动力学参数Km和Vmax(±SE)分别为1.8(±0.22)mM和114.6(±8.4)U/mg蛋白，其催化效率(Kcat/Km)为42.4 mM-1s-1。
AnTrx和AnTrxR的融合、表达纯化及其与亲本AnTrx和AnTrxR的酶活特性比较分析及在食品工程中的应用采用SOE法将麻风分歧杆菌(Mycobacterium leprae)中连接TrxR和Trx的天然连接肽Linker A和人工设计的柔性肽(GGGGS)3 Linker B插入AnTrx和AnTrxR之间，并颠倒两者顺序，得到四个融合酶AnTrxR-Linker A-AnTrx(RMT)、AnTrxR-Linker B-AnTrx(RGT)、AnTrx-Linker A-AnTrxR(TMR)和AnTrx-LinkerB-AnTrxR(TGR)。将分别在E.coli中表达的各融合酶与独立表达的AnTrx体系进行比较分析，首先用二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)还原法还原AnTrx后测定各自不依赖AnTrxR的酶活，再测定各自还原特异性底物NADPH、DTNB、AnTrx和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的酶活(一分子的氧化型谷胱甘肽(GSSG)被还原成两分子的还原型谷胱甘肽(GSH))。最后利用毓基特异荧光分子探针(mBBr)结合巯基后的荧光显色，分析其还原食品蛋白中二硫键的能力。结果显示，在DTT对AnTrx的还原反应中，融合蛋白中AnTrx部分的活性均低于单独表达的AnTrx活性，依次排序为AnTrx>TGR>TMR>RGT>RMT。进一步分析发现，当AnTrxR在N端融合时，AnTrxR的催化效率明显高于其在C端融合的催化效率。除TMR和TGR之外，RMT和RGT中的AnTrxR还原DTNB和NADPH的催化效率(Kcat/Km)比亲本的AnTrxR要高。在DTNB的还原反应中，RMT和RGT的催化效率分别是亲本的AnTrxR的65.8和33.5倍。在NADPH的还原反应中，二者分别是亲本的AnTrxR的3.7和1.4倍。但是，在上述反应中，RMT和RGT中AnTrx部分的催化效率均低于亲本的AnTrx，在GSSG的的还原反应中，二者的催化效率分别是单独表达的AnTrx的46％和68％。在依赖于DTT还原牛胰岛素的反应中，二者的催化效率分别为亲本的AnTrx的31.8％和7.5％。与麦醇溶蛋白共孵育3h后，亲本蛋白(AnTrx、AnTrxR)和融合蛋白在还原麦醇溶蛋白二硫键的催化效率上未见有显著差异。各自结合mBBr荧光条带的亮度也未见明显区别。
以上结果表明，AnTrx、AnTrxR及其融合蛋白都具有Trx体系的活性。单独表达的AnTrx体系和融合表达的AnTrx体系都可还原麦醇溶蛋白中的二硫键。尽管融合蛋白的AnTrx的系统活力低于单独表达的AnTrx的系统活力，但是在还原麦醇溶蛋白的二硫键时，只要孵育时间足够长，其还原二硫键的效果相近。