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猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PRoV)是仔猪常见的重要病毒性腹泻病原,临床上均以呕吐、厌食、腹泻、脱水为主要特征,仔猪的发病率和死亡率较高,给养猪业造成重大经济损失。尤其是PEDV变异株,是近年来仔猪腹泻的主要病原。由于临床症状极其相似,难以区分,只能借助实验室手段加以鉴别诊断。建立PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV快速鉴别检测方法,开展PEDV分子流行病学研究,对仔猪病毒性腹泻的诊断和防控具有重要意义。1.PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用为鉴别检测PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,本研究分别针对PEDV N基因、TGEVM基因、PDCoVN基因和PRoVVP6基因设计特异性引物,经过优化反应条件,建立了同时检测并区分4种病毒的多重RT-PCR方法。结果,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其他主要病毒无交叉反应,具有很强的特异性;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的最低检出下限分别为1.57×10~2拷贝/μL、1.57×10~3拷贝/μL、1.57×10~2拷贝/μL、1.57×10~2拷贝/μL,具有很高的敏感性;在相同条件下进行重复性试验,获得结果一致。应用所建立的方法检测临床采集的270份腹泻病料,结果PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为15.56%、11.48%、10.74%1.85%,并且存在混合感染现象。表明,本研究建立的多重RT-PCR方法为临床样品中PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段2.PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用为鉴别检测PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,分别针对PEDVN基因、TGEV M基因、PDCoV M基因和PRoV VP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测并区分4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其他主要病毒无交叉反应,具有很强的特异性;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的最低检出量分别为2.06×10~2拷贝/μL、2.06×10~2拷贝/μL、2.06×10~1拷贝/μL、2.06×10~3拷贝/μL,具有很高的敏感性;组内与组间重复性试验的变异系数均小于1.1%,具有良好的重现性。应用所建立的方法检测临床采集的243份腹泻病料,结果PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为11.93%、15.64%、9.05%、9.47%,并且存在混合感染现象。应用上述建立的PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重RT-PCR方法对相同病料进行检测,结果PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为10.29%、13.17%、7.82%、7.40%,两者的符合率为96.71%。表明,本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法为临床样品中PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。3.2017-2019年广西PEDV分子流行病学研究为掌握广西PEDV流行毒株的遗传变异情况,本研究对2017-2019年从广西各地采集的腹泻病料,应用所建立的PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV多重RT-PCR检测方法进行检测,对PEDV阳性样品随机抽取部分样品进行S、M、N基因的扩增、测序和分析。结果,共检测2017-2019年采集的病料1454份,PEDV阳性157份,阳性率10.80%。经扩增、克隆、测序,获得PEDV S基因23株、M基因和N基因各25株。同源性分析表明,广西流行株间核苷酸和氨基酸序列同源性在S基因分别为90.7%-100%和85.0%-100%,在M基因分别为97.5%-100%和97.4%-100%,在N基因分别为96.3%-100%和97.1%-100%。序列比对分析表明,广西流行毒株S1基因的氨基酸序列存在缺失、变异和插入现象,且广西各毒株之间存在差异。进化速率分析表明,PEDV S基因进化速度最快。基于S、M、N基因绘制遗传进化树,获得相似的拓扑结构图,广西流行毒株在GⅠa、GⅠb、GⅡa、GⅡb亚群均有分布,主要集中在GⅠb、GⅡa亚群。表明,PEDV广西流行毒株均有遗传多样性,应加强病原监测和流行病学调查,为有效防控PED提供基础数据。