论文部分内容阅读
猪链球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）是猪链球菌35个血清型中主要的流行血清型，人兽共患，临床上能引起人和猪的脑膜炎、关节炎及败血症。我国先后于1998年和2005年暴发了两次SS2感染人的事件，不仅使养猪业经济损失重大，还对人类健康造成威胁，引发人群公共卫生安全问题。 蛋白质磷酸化是细胞信号转导系统的核心，其中激酶与磷酸酶分别介导磷酸化与去磷酸化过程，调控相关蛋白的功能和细胞生命活动的进行，丝氨酸/苏氨酸(Serine/threonine)的磷酸化与去磷酸化作用对细胞的生长代谢至关重要。原核生物的Stks(Serine/threonine kinases)和Stps(Serine/threonine phosphatases)能够通过对靶蛋白进行翻译后修饰进行调控，即细菌可以通过Stks磷酸化和Stps去磷酸化作用，改变底物蛋白的构象或性质，调节其活性和功能，或间接调控下游靶基因的表达，以适应在不同环境中的生存。 SS2中有两个编码Stp的基因stp1和stp2，本研究旨在:(1)比较SS2去磷酸酶Stp1与Stp2酶学特性差异;(2)探究stp1与stp2基因缺失对SS2致病性的影响。 1.重组Stp1与Stp2酶学特性比较 通过体外原核表达与纯化，获得SS2的重组Stp1和Stp2蛋白，采用经典pNPP试验，比较了磷酸酶Stp1与Stp2的酶学特性。通过试验优化获得Stp1与Stp2的最适反应条件，包括最适金属离子种类、离子浓度、反应pH以及温度，并在最适条件下进一步测定并比较两者的酶活。结果表明:Stp1具Mn2+依赖性，在1.0mM Mn2+、pH8.0和37℃时有最大反应活性;而Stp2为Mn2+或Mg2+依赖性，在μM级Mn2+、pH7.0-8.0和25-60℃时均有较高活性。Stp1酶动力学参数Km值为25.43±6.61mM，Vmax值为44.84±4.86μM/min;Stp2Km值为13.94±3.90mM，Vmax值为120.8±13.94μM/min。酶的比活力Stp1为2.25IU/mg，Stp2达24.16IU/mg，Stp2的活性高于Stp1。 2.猪链球菌2型stp1与stp2基因功能比较分析 利用同源重组法成功构建SS2基因缺失株Δstp1、Δstp2和Δstp1-stp2，分别进行生长、氧化应激、溶血、细胞黏附、细胞毒性与小鼠致病性试验，比较分析Stp1与Stp2可能参与的生物学过程。结果显示:与亲本株相比，Δstp1和Δstp1-stp2的生物学特性相似，即stp1缺失后细菌易于成链，单个菌体变长变大，抗氧化应激能力增强(P＜0.01)，溶血活性、Hep-2细胞黏附能力及致上皮细胞毒性作用增强（P＜0.01），对小鼠的致病性下降(P＜0.01)。而Δstp2与亲本株相比，其对生长、溶血、细胞黏附作用不明显，对小鼠致病力有一定程度下降（差异不显著），可能与其在细菌中的表达量较低有关。 综上所述，虽然Stp2的体外酶活性显著强于Stp1，但对细菌的抗氧化应激、溶血、黏附、小鼠致病力等方面起作用的是Stp1，提示Stp1在SS2感染与致病性中起主要作用。