我国纤维素资源丰富,因其具有水不溶性高结晶结构,很难有效分解,处理方式不当会极大浪费可再生糖类资源。低温内切β-葡聚糖酶(EglC)在较低温度下有效水解纤维素为单糖或寡糖,在我国冷凉期较长的地区有较大的应用优势。食木性白蚁肠道共生微生物具有高效降解纤维素的能力,含有丰富的产内切β-葡聚糖酶微生物资源。然而从白蚁肠道直接分离的EglC野生菌株具有产酶能力低下和分离纯化困难的缺点,限制了其应用。随着分子生物学的迅速发展,基因表达技术已成为实现外源蛋白表达、纯化和生产的有效途径。本研究从我国南方广泛分布的食木性白蚁(圆唇散白蚁)肠道微生物中筛选、分离和鉴定产低温内切β-葡聚糖酶的微生物,并克隆其低温EglC基因,构建大肠杆菌和毕赤酵母表达载体,实现异源表达;分析低温EglC基因密码子结构,对其进行优化,提高该基因在毕赤酵母中的表达水平;并系统研究了重组低温内切β-葡聚糖酶性质,为其应用奠定基础。试验分为六部分:1圆唇散白蚁肠道产低温内切β-葡聚糖酶(EglC)共生菌筛选及酶的分离纯化利用低温诱导培养法,以圆唇散白蚁肠道悬浮液为样本,对白蚁悬液进行低温内切β-葡聚糖酶细菌的分离纯化。结果表明,从圆唇散白蚁肠道微生物中筛选了一株产低温内切β-葡聚糖酶的细菌A1,粗酶活性为0.8U/mL。利用PCR成功扩增菌株16S rRNA条带(1402 bp)。同源分析结果表明,该菌株16S rRNA与Citrobacter farmeri W17-1和Citrobacter farmeri17.7KSS同源性达99%。进化树分析结果表明,A1菌株与Citrobacter farmeri17.7KSS菌株亲缘关系最近(同源性99%),表明A1菌株属于Citrobacter farmeri,命名为Citrobacter farmeri A1。将所得 16S rRNA 序列提交至 NCBI的GeneBank数据库,GeneBank登陆号为:KT313001。通过层析技术分离纯化低温EglC,SDS-PAGE结果表明获得单一特异性条带(分子量为38kDa左右),纯化效果较好(电泳级纯度)。该低温酶最适pH为7.0,在pH 6.5-8.0之间保持较高的酶活;并具有良好的pH稳定性,在pH 3.5-pH 6.5孵育30 min,该酶仍能保持相对酶活的60%以上。低温EglC最适温度为30-40℃,当温度超过70℃时,相对酶活显著降低。然而,温度为5℃时,仍能保持较高的相对酶活(50%以上),说明EglC属于低温酶。2 Citrobacter farmeri A1低温内切β-葡聚糖酶(EglC)基因的扩增、克隆及其序列分析通过设计简并引物从圆唇散白蚁肠道细菌Citrobacter farmeriA1中扩增了低温内切β-葡聚糖酶(EglC)基因的保守片段(约600 bp),进一步利用染色体步移技术扩增低温EglC基因的全长。EglC基因全长为1107 bp,编码368个氨基酸,GC含量58.08%。该基因序列已提交至NCBI GeneBank数据库,GeneBank登陆号为:KT313000。Citrobacter farmeri A1 EglC 氨基酸序列与E.coli CFT073、Burkholderiasp.CCGE1002、Cupriavidus taiwanensis、Pseudomonas fluorescens SBW25和X n homonas campestris pv.vesicatoria strain 85-10 的内切 β-葡聚糖酶同源性分别为 86.4%、43.4%、44.7%、39.7%和44.3%。序列分析显示Citrobacterfarmeri A1低温EglC基因具有典型的内切β-葡聚糖酶序列特征,属于糖苷水解酶第8超家族(glycoside hydrolase 8 superfamily)。利用SignalP4.1 Server软件在线分析EglC信号肽,该蛋白信号肽为1-21个氨基酸,符合常规分泌型蛋白酶信号肽位点规律。3 Citrobacter farmeriA1低温内切β-葡聚糖酶(EglC)基因在大肠杆菌中的表达及重组酶酶学性质分析根据试验二EglC基因全长序列及表达载体pET-22b的特点,设计去除信号肽序列和添加相对应酶切位点的原核表达引物,以试验二含有全长基因的T克隆质粒为模板,扩增原核表达EglC基因,连接进入原核表达载体pET-22b中,转化大肠杆菌BL21得到能够分泌重组低温内切β-葡聚糖酶(EglC22b)的基因工程菌E.coli pET22b-EglC。超声波破碎重组菌获得粗酶液,活性为9.5 U/mL,相比原始菌株内切葡聚糖酶活力(0.8 U/mL)提高了 11.9倍;通过Ni亲合层析柱进行纯化,SDS-PAGE结果表明,重组菌分子量大小为42 kDa,比活力为8.7 U/mg。重组酶EglC22b最适pH为7.0,在pH 6.5-8.0范围内,保持85%以上酶活;其具有较宽的pH稳定性范围,在pH 3.5-6.5区间内仍保持最高酶活的60%以上。重组酶最适反应温度为30～40℃,且在5℃仍保持50%以上酶活;40℃和50℃时保温30 min,EglC22b相对酶活能保持90%以上,具有较好的稳定性,而温度高于60℃时稳定性较差。EglC22b活性被Co2+激活,Zn2+、Li+、DMSO、Tween 80、EDTA和SDS对重组酶活力有不同程度的抑制作用。以上结果表明,Citrobacter farmeriA1低温EglC基因成功在大肠杆菌中进行表达,重组基因工程菌表达水平得到提高,并且重组酶EglC22b仍属于低温酶。4Citrobacter farmeri A1低温内切β-葡聚糖酶(EglC)基因与新型标签Protein S tag的融合表达将来自于Myxococcus xanthus的新型融合标签Protein S(ProS)tag与目标蛋白EglC的N端融合,共同转入E.coliBL21中进行共表达,增强靶蛋白的积累速度和溶解度,提高生产水平。此外,在EglC基因C端加入His-tag,方便靶蛋白的纯化,并对重组酶酶学性质进行测定分析。蛋白表达基因工程菌命名为E.coli BL21-pET(ProS-EglC),通过IPTG对重组菌进行诱导,利用超声波破碎细胞,离心收集重组酶,命名为ProS-EglC。SDS-PAGE结果显示通过Ni-AgaroseHis标签蛋白纯化试剂盒纯化后,在电泳图大约60 kDa处出现了较为清晰的特异性条带。酶活测定结果表明,重组菌粗酶液活力为12.4U/mL,均比亲本酶(0.8U/mL)和EglC22b(9.5 U/mL)活性要高。重组酶ProS-EglC最适反应pH为7.0,在pH6.5-8.0之间活性较高,并具有良好的pH稳定性。ProS-EglC最适温度为30-40℃,当温度低于5℃时,酶活还保持最高酶活的50%以上,与亲本酶和EglC22b的温度性质一致。Co2+可增强重组酶活性,而Zn2+、Li+、DMSO、Tween80、SDS和EDTA会抑制重组酶活性。5Citrobacter farmeri A1低温内切β-葡聚糖酶(EglC)基因在毕赤酵母中的表达及重组酶酶学性质分析根据EglC基因全长序列及真核表达质粒pPICZαA的特点设计真核表达引物PEglC-F和PEglC-R,以试验三含有T克隆质粒pMD20-T-EglC为模板,扩增得到真核表达基因PEglC,将该基因的正确开放阅读框融合于新一代真核表达质粒pPICZαA上,再整合进入P.pastoris X-33染色体,可望高效表达靶基因的编码产物。重组菌P.pastorispPICZαA-PEglC,经0.8%的甲醇诱导96 h后,粗酶液酶活达21.6 U/mL。SDS-PAGE电泳分析显示分子量约38 kDa。重组酶最适pH是7.0,在pH 6.0-8.0内保持85%以上残余酶活。该酶最适温度为30-40℃,5-20℃仍具50%以上酶活,在40-50℃具有良好的稳定性,说明该酶属于低温酶。不同化学试剂和金属离子对重组酶P-FglC的影响结果表明Co2+可增强重组酶活性;Zn2+、Li+、DMSO、Tween80、EDTA和SDS会抑制其活力。6低温内切β-葡聚糖酶(ElgC)基因的密码子优化设计及其在毕赤酵母中的表达虽然基因工程菌Pichia astoris pPICZaA-PEglC既是分泌表达,又显著提高了表达水平,但是其表达水平还有进一步的提升空间。利用全基因合成技术,对基因进行密码子优化,提高重组内切β-葡聚糖酶的表达水平。在不改变原基因氨基酸的基础上,优先采用Pichia pastoris频率最高的同义密码子,少数采用次偏爱密码子,尽量平衡AT与GC含量,降低mRNA二级结构的稳定性,设计并全基因合成优化后的低温内切β-葡聚糖酶基因。优化基因SEglC与原基因核苷酸序列比较结果表明两者同源性约为70.89%,G+C含量从58.4%降到41.1%。运用GeneQuest软件对原基因和优化基因的RAN二级结构折叠情况进行预测,自由能由-296.03 kJ/mol(EglC)变为-184.08 kJ/mol(SEglC)。将分泌型真核表达质粒pPICZaA-SEglC电转化至Pichia pastoris X-33染色体中得到阳性转化子,优化后的SEglC表达水平明显高于原EglC基因的表达。重组菌Pichia pastoris pPICZaA-PEglC经甲醇诱导96 h后,发酵表达量可达633μg/mL,粗酶液活性达到36.2U/mL。重组菌经十代连续培养诱导,染色体仍含有SEglC基因,具有良好的遗传稳定性。综上所述,本研究成功从白蚁肠道内筛选出产低温内切β-葡聚糖酶的菌株Citrobacter farmeriA1,并纯化该低温EglC,酶学性质表明该酶属于低温酶。为了进一步提高产酶水平,经过宿主和密码子的双重优化,最终构建了高产低温内切β-葡聚糖酶基因工程Pichia pastoris pPICZaA-SEglC,其产量高于原基因在E.coli和Pichia pastoris中的表达水平,更是天然菌株Citrobacter farmeri A1产酶水平的45.3倍。因此,本研究结果丰富了白蚁肠道内切β-葡聚糖酶的基因库资源,为开展低温内切β-葡聚糖酶的外源表达及活性功能研究提供了借鉴,并为其今后在生产中的应用奠定基础。