研究背景结核病（Tuberculosis,TB）是全球单因素致死率最高的传染性病原体,主要由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）感染引起。去泛素化是泛素化的逆反应过程,主要表现为靶蛋白上的泛素链被分解,泛素分子单个解离的过程。泛素特异性蛋白酶25（USP25）是去泛素化酶家族中研究较多蛋白的一员,近年来的研究表明,USP25在介导内质网蛋白质降解、调控TLR4信号通路,参与肌生成、抗病毒感染、介导癌症发生发展等方面发挥了重要作用。但USP25抗MTB感染机制尚不清楚。本课题研究了 USP25调控巨噬细胞在机体抗结核感染免疫能力。我们发现当MTB感染后,USP25可以活化ERK信号通路,促进IL-6,IL-1β,TNF-α等细胞因子的表达。进一步的研究表明,USP25与B-Raf和C-Raf相互作用,通过其去泛素化酶功能减少B-Raf和C-Raf的泛素水平,从而促进机体抗结核感染免疫能力。研究方法（一）小鼠体内实验确定USP25对MTB的抑制作用。1.平板菌落计数实验（CFU）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和Griess法检测H37Rv感染第7天和第28天后小鼠的肺脏、脾脏组织的荷菌量和组织研磨液上清中细胞因子的表达;（二）USP25调控巨噬细胞中的抗结核免疫效应1.实时荧光定量 PCR（Real-time PCR）和 Western Blot 检测 H37Rv 感染WT小鼠来源BMDM后USP25的表达;2.CFU 和 Real-time PCR 检测 H37Rv 感染 BMDM 后,USP25 对 MTB 的抑菌效应和对细胞因子的影响;（三）USP25通过调控ERK信号通路发挥抗结核效应。1.Western Blot检测H37Rv感染BMDM和THP1 Mφ后信号通路蛋白磷酸化的影响。2.Real-time PCR检测阻断ERK信号通路后,H37Rv感染后BMDM和THP1 Mφ中细胞因子的变化。（四）验证与USP25相互作用的蛋白。1.CO-IP和Western Blot分别在BMDM和293T细胞中检测USP25与B-Raf与C-Raf相互关系。（五）验证USP25的去泛素化酶功能参与抗MTB的进程。1.构建慢病毒进行回复性实验,CFU和Real-time PCR分别检测当H37Rv感染后USP25的去泛素化酶功能对MTB抑制作用和细胞因子表达的影响。2.CHX和MG132分别预处理BMDM并H37Rv感染后,Western Blot检测USP25对B-Raf和C-Raf降解速度影响和降解途径影响。3.MG132 预处理 293T 细胞和 Usp25--BMDM 并 H37RV 感染后,CO-IP和Western Blot检测USP25通过其去泛素化酶功能修饰B-Raf和C-Raf的泛素化水平。研究结果1.USP25可以促进巨噬细胞对MTB的抑制作用,同时促进细胞因子的表达。2.USP25通过激活ERK信号通路,对B-Raf和C-Raf进行去泛素化调控,进而发挥抗MTB效应。研究结论USP25在巨噬细胞中通过其去泛素化酶功能,减少B-Raf和C-Raf的泛素水平,增强B-Raf和C-Raf稳定性,从而正调ERK信号通路,促进TNF-α和IL-6等细胞因子的表达,进而发挥抗结核效应。