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研究背景与目的:天麻是我国名贵中药材之一,具有很高的药用价值。其药理活性成分中天麻素的含量最高,因此,天麻素被公认为天麻的主要有效成分。天麻素具有镇静、镇痛、抗惊厥等多种药理作用,且毒性低,不良反应少,在临床上已被广泛应用于眩晕、失眠、神经痛的治疗。天麻素作用于脑部的苯二氮卓受体,可增强γ-氨基丁酸-苯二氮卓受体复合体的功能,从而发挥中枢神经抑制作用。由于其为水溶性药物,具有较强的极性,普遍认为天麻素跨膜能力弱,口服生物利用度较差,往往需在水解为苷元才能被吸收,但实际上天麻素却口服吸收较快（Tmax=0.8 h）,且生物利用度较高（约86%）。针对这一有趣现象,课题组前期对天麻素的肠吸收机制展开了初步研究。因为天麻素水溶性极强,推测其不是通过被动扩散,而是经载体介导进入体内。由于其结构中含有一分子葡萄糖结构,所以预测其很有可能经葡萄糖转运途径完成转运吸收。研究发现,葡萄糖能竞争性地抑制天麻素的肠吸收速率,加入SGLT1抑制剂根皮苷可显著抑制天麻素的肠吸收,但尚未见分子水平的验证。此外,有研究证实天麻素可透过血脑屏障进入脑内,但到目前为止,关于天麻素跨血脑屏障的途经尚不清楚,由于天麻素药效作用的靶部位即为脑,故对其跨血脑屏障转运机制的研究就显得十分重要。根据前期研究结果,我们推测天麻素跨血脑屏障可能也与其肠吸收过程一样,是借助葡萄糖转运途径完成的。基于以上研究背景,本课题重点探究天麻素跨肠道及血脑屏障的转运机制。研究方法和内容:1、通过体内动物实验探究天麻素跨肠屏障的转运机制,采用大鼠药物动力学实验,采用UPLC法测定血浆中的天麻素浓度,考察不同浓度葡萄糖和SGLT1抑制剂根皮苷对天麻素肠吸收的影响;采用q-PCR实验,测定大鼠各肠段的葡萄糖转运体Sglt1和Glut2 mRNA相对表达量,采用Western blot实验,测定大鼠各肠段的葡萄糖转运体SGLT1和GLUT2蛋白相对表达量。2、通过体外细胞实验考察葡萄糖转运体表达的影响因素,在此基础上进行后续天麻素跨肠道屏障的转运机制研究。首先通过细胞摄取实验,考察不同浓度葡萄糖和SGLT1抑制剂根皮苷对天麻素摄取的影响;然后构建Caco-2和MDCK转运模型,进行天麻素体外转运实验以预测其在肠道转运能力;最后,通过比较不同葡萄糖转运体抑制剂对天麻素转运的影响来探究天麻素跨肠道屏障的转运机制。将Caco-2和MDCK转运实验结果进行比较,分析结果的相关性以及两种细胞模型适用性。3、通过小鼠尾静脉实验和体外血脑屏障细胞模型探究天麻素跨越血脑屏障的转运机制。为了判断天麻素是否可以进入脑组织,以及加入GLUT1抑制剂根皮素对天麻素入脑的影响,将小鼠尾静脉注射天麻素,通过UPLC法测量小鼠脑组织中天麻素的含量;使用HBMEC和HA细胞共培养构建血脑屏障细胞模型,进行天麻素体外转运实验以探究天麻素跨越血脑屏障的转运机制。4、采用分子对接技术将天麻素和葡萄糖转运体SGLT1和GLUT1进行对接,模拟天麻素与以上两种葡萄糖转运体的结合位点和结合能力,将天麻素与葡萄糖进行对比,比较天麻素和葡萄糖与同一葡萄糖转运体结合方式的叠合度,从而判断天麻素在体内是否经由以上两种葡萄糖转运体转运。结果与结论:1、大鼠体内药动学结果显示,葡萄糖可以与天麻素竞争吸收,竞争作用随葡萄糖浓度升高而增强;根皮苷可以抑制天麻素的吸收,抑制作用随根皮苷浓度升高而增强。根皮苷通过下调SGLT1的肠道表达从而抑制天麻素的肠吸收,进一步说明天麻素肠吸收由SGLT1介导。2、Caco-2摄取实验结果与体内药动学实验结果一致,加入葡萄糖或根皮苷都可以减少天麻素的摄取,并且加入根皮苷可以下调SGLT1在Caco-2上的表达。在Caco-2转运模型上,天麻素浓度与其转运水平呈剂量依赖性,加入抑制剂根皮苷后能显著减少天麻素转运;在MDCK转运模型上,天麻素转运水平无剂量依赖性,加入抑制剂根皮苷后能显著减少天麻素转运,以上实验均说明天麻素跨肠屏障主要是由SGLT1介导。3、天麻素在Caco-2和MDCK转运模型上的Papp值均大于10-6cm/s,说明天麻素口服吸收良好,这与其高生物利用度相符,但是,天麻素在两种细胞模型上的转运结果略有差别,是由于两种细胞的葡萄糖转运体表达水平不一致,MDCK细胞上的葡萄糖转运体表达水平低于Caco-2细胞,在给予低浓度天麻素时MDCK细胞的葡萄糖转运体已经饱和,故无剂量依赖性。4、小鼠尾静脉实验结果显示,天麻素可以跨越血脑屏障,加入GLUT1抑制剂根皮素后,其入脑含量显著降低,说明该过程主要由GLUT1介导。天麻素在血脑屏障细胞模型上的Papp值为10-8 cm/s,说明其跨越血脑屏障能力差,加入GLUT1抑制剂根皮素后,其转运能力显著下降,证明天麻素跨血脑屏障主要是由GLUT1介导。5、通过分子对接实验发现天麻素与SGLT1和GLUT1的结合位点和结合方式都与葡萄糖相似度极高,所以可以认为天麻素和葡萄糖转运过程相似,即在肠道经SGLT1介导跨膜转运,在脑部经GLUT1介导跨膜转运。综上所述,本课题通过采用体内药动学实验、体外细胞转运模型、分子生物学实验及计算机模拟分子对接技术,共同证明:天麻素跨肠道屏障由SGLT1介导,跨血脑屏障由GLUT1介导。