研究背景:流感病毒（Influenza virus）是造成世界范围内季节性流感的主要病原体,其中一些分型的甲型流感病毒株会导致人和动物较高的死亡率。由于甲型流感病毒（IAV）抗原易变异且亚型众多,极易引起大范围流行,给人类健康造成严重威胁,所以预防和控制流感病毒感染成为人们普遍关注的焦点。目前常用的抗流感病毒药物主要是神经氨酸酶抑制剂和M2离子通道抑制剂,然而这些药物的耐药性已经不断被报道,因此迫切需要研制新的尤其是不同作用机制的抗流感病毒药物。流感病毒的生命周期可简洁归纳为吸附、融合、入核、复制、组装和释放等过程。其中吸附和融合是流感病毒感染细胞的进入阶段,抑制该过程能够在病毒感染的早期阶段阻断复制的环节,降低血浆的病毒载量,具有预防和治疗的双重作用,目前受到了人们的普遍重视。在这一过程中,病毒表面的血凝素蛋白（HA）与宿主细胞表面上唾液酸分子（SA）之间的相互作用是病毒进入宿主的首要步骤。研究表明,HA与SA之间是通过多价相互作用的,这种结合使得病毒与宿主细胞的结合具有高特异性和高亲和力,这一特点对开发靶向HA的抗病毒药物带来了巨大的挑战。为此,本课题从寻找不同于现有作用机制的抗流感病毒药物出发,通过阻断病毒包膜-宿主细胞膜之间的融合,设计合成了一系列能与HA2亚基多价结合的具有阻止病毒进入宿主同时又具有抗炎活性双重作用的树状大分子肽。从这一系列类似结构的树状肽中,筛选出一化合物FMOC-4-KKWK,能在保持较高抗病毒活性的同时显著降低其细胞毒性。在此基础上,深入探究了其体外抗流感病毒的活性、对宿主细胞的毒性,初步的抗炎活性,可能的作用机制以及小鼠体内活性。虽然目前通过用树状结构的分子抑制HA与宿主SA之间多价结合的工作有所报道,但本研究是首次针对HA2亚基,通过构筑多价分子以抑制病毒-细胞膜融合的尝试,这一工作的成功实施为抗流感病毒多肽类药物提供了新的设计思路。动物来源放线菌的次级代谢产物结构多样,蕴含着大量具有药用价值的化合物,显示了较好的应用前景。在本论文的第二部分,基于我们前期分离得到一株放线菌Streptomyces cavourensis HTL16,以及从该菌中分离纯化出一个新的Bafilomycin类化合物和其他7个已知的Bafilomycins类化合物这一工作,本研究中,我们探讨了这些Bafilomycins的抗病毒活性和潜在的作用机制,期望从动物来源放线菌中寻找广谱、高效的抗病毒化合物。研究方法:1.FMOC多肽固相合成方法合成多肽,凝胶柱纯化后用高效液相色谱法（HPLC）检测纯度,经电喷雾电离质谱（ESI）确定分子量并通过核磁共振谱（NMR）进一步进行结构确定。2.通过动态光散射（DLS）测定化合物Zeta电位。3.通过致细胞病变（CPE）实验测定树状多肽对多种不同流感病毒株的半数抑制率,初步确定它们的抗流感病毒活性。4.MTT、CCK-8法检测树状多肽对MDCK、RAW264.7的细胞毒性。5.间接免疫荧光实验、荧光实时定量PCR进一步确证树状多肽抗病毒活性。6.诱导耐药实验测定流感病毒是否容易对树状肽产生耐药性。7.采用不同给药模式的CPE、单轮复制时间点实验、血凝抑制实验、溶血抑制实验、合胞体形成抑制实验、表面等离子共振（SPR）实验等确证树状肽抗病毒作用机制,通过透射电镜（TEM）观察多肽对流感病毒外形及结构的影响。8.荧光素酶报告基因法检测树状多肽对NF-κB的调控作用。9.荧光实时定量PCR、酶联免疫吸附实验检测树状多肽对流感病毒或脂多糖诱导的RAW 264.7细胞中IL-1β、IL-6及TNF-α表达的影响。10.滴鼻感染建立小鼠流感病毒感染模型,通过小鼠生存率、体重变化、肺指数、肺部病毒血凝滴度和病理切片实验确证树状肽对小鼠的保护作用。11.高效液相色谱法测定树状肽在小鼠体内的达峰时间。12.MTT法测定Bafilomycins化合物的细胞毒性,采用全程给药和预处理病毒测试Bafilomycins的抗流感病毒活性。13.间接免疫荧光实验、荧光实时定量PCR确证Bafilomycins抗病毒活性。14.质子泵抑制实验探究Bafilomycins类化合物对V-ATP酶的抑制作用。实验结果:1.通过合理设计,合成了一系列树状肽和单体肽,其纯度不低于95%,并通过ESI-MS,NMR等确认了它们的结构。2.这些肽类化合物Zeta电位为22-60mA。3.在预处理病毒模式下,树状肽类化合物对PR8病毒株IC50为0.10-0.77μM,而相应单体肽IC50为4.02-4.04μM。4.不同给药模式的CPE实验表明树状肽在预处理细胞、预处理病毒和同时给药模式下均有较好的抗病毒活性,且对A/Puerto/8/34（H1N1）（PR8）,A/Puerto Rico/8/34（H1N1）的 NA-H274Y 突变株,A/Aichi/2/68（H3N2）,A/FM/1/47 小鼠适应株（H1N1）,临床分离株699（H3）及B型流感病毒株均表现出较高的抑制作用。其中FMOC-4-KKWK选择性指数为149.57。树状肽在不同给药模式下均显著抑制PR8病毒的NP蛋白表达,也显著抑制PR8病毒的M1蛋白、HA蛋白的mRNA表达。TEM实验显示树状多肽能破坏流感病毒表面形状和结构。5.单轮复制时间点实验表明,FMOC-4-KKWK和NPA-4-KKWK能在病毒复制的早期阶段降低病毒的滴度;凝血抑制,溶血抑制,以及合胞体形成抑制实验表明FMOC-4-KKWK和NPA-4-KKWK能与HA2亚基作用;通过SPR实验进一步测得其与PR8流感病毒HA蛋白亲和力常数（KD）分别为6.65×10-12 M、7.42×10-12 M。上述结果表明树状多肽可能通过与HA2作用,抑制病毒-细胞膜融合,进而阻止病毒进入宿主从而产生抗病毒活性。6.诱导耐药实验表明FMOC-4-KKWK对未进行诱导处理的PR8病毒IC50为0.28±0.09μM,而对用FMOC-4-KKWK处理了 10代的PR8病毒的IC50为0.32±0.03μM,表明PR8病毒株对该树状肽不易产生耐药性。7.树状肽对NF-κB产生抑制作用,并显著降低LPS及PR8流感病毒诱导产生的IL-1β、IL-6及TNF-α的表达,表现出显著的抗炎活性。8.动物实验表明树状肽能提高病毒感染小鼠的生存率和延长存活时间。小鼠感染PR8病毒一天后给药时,FMOC-4-KKWK高低剂量（5mg/kg、1.25mg/kg）对病毒感染小鼠的生命保护率分别为30%和20%;小鼠感染病毒后立刻给药时,FMOC-4-KKWK（5mg/kg）及 NPA-4-KKWK（5mg/kg）对病毒感染小鼠的生命保护率分别为20%和40%。9.HPLC法测定腹腔注射时小鼠血浆中FMOC-4-KKWK的含量,小鼠体内FMOC-4-KKWK含量在1h最高,4h后明显减少。10.Bafilomycins类化合物对IAV和SARS-CoV-2病毒表现出高效的抗病毒活性,IC50值在纳摩尔范围内。11.V-ATP酶质子泵抑制实验表明,Bafilomycins类化合物抑制病毒进入可能与抑制V-ATP酶活性有关。实验结论:1.合理设计并合成了一系列能与病毒HA多价结合的树状肽类化合物。研究发现,脂肪链树状肽的抗病毒活性随着脂肪链长度的增长而增强,毒性也随之增大;芳香酸树状肽的芳香环越大,细胞毒性越小;芳香酸树状肽毒性小于脂肪肽。其中FMOC-4-KKWK选择性指数为149.57,该树状肽在不同给药模式下和对多种不同亚型病毒株均有较高抑制IAV活性。2.本研究合成的四价肽活性是相应单体肽抗流感病毒活性的14-21倍,结合上述各实验,推测其抗病毒作用的机制为与流感病毒HA亚基多价作用,抑制病毒与宿主细胞膜融合,同时也能调控NF-κB通路,抑制病毒导致的炎症因子的过高表达,表现出一定的抗炎活性。3.PR8病毒株对FMOC-4-KKWK不易产生耐药性,NPA-4-KKWK对SARS-CoV-2病毒也有较高抑制活性。4.FMOC-4-KKWK及NPA-4-KKWK能提高PR8流感病毒感染小鼠的生存率,减轻小鼠肺部病毒载量和病变程度,对小鼠有一定生命保护作用。FMOC-4-KKWK腹腔注射时体内达峰值时间约为1小时。5.Bafilomycins有较高抗IAV和SARS-CoV-2病毒活性,可能是通过抑制V-ATP酶的活性而发挥抗病毒效果。