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背景及目的:肿瘤的细胞免疫治疗已经成为肿瘤治疗的重要手段之一。但是当前免疫治疗的效果不甚理想,其主要原因之一便是肿瘤微环境的存在,导致细胞毒性T细胞对肿瘤的杀伤能力减弱,或者靶向性的缺失,无法准确地识别肿瘤细胞。M2型巨噬细胞作为肿瘤微环境主要的免疫抑制细胞之一,除了可以诱导肿瘤细胞发生免疫逃逸以外,还可以通过TGF-β途径抑制细胞毒性T细胞的功能,因此本研究的主要目的之一是证实高表达环氧合酶2（cyclooxygenase 2,COX-2）的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）细胞系可以通过PGE2诱导单核细胞向M2型巨噬细胞转化,从而影响激活后CD8+T细胞产生颗粒酶B和IFN-γ的能力。另外,树突状细胞（dendritic cell,DC）疫苗作为细胞免疫治疗的重要手段之一,其主要作用是通过将肿瘤抗原呈递给细胞毒性T细胞,从而增强细胞毒性T细胞的靶向性。但是因为肿瘤微环境的存在,且树突状细胞无法在体外进行大量扩增,使得患者来源的DC细胞数量有限,且呈递肿瘤抗原的能力不足,所以本研究的另一个目的是应用体外模型,将诱导多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）来源的造血祖细胞（hematopoietic progenitor cell,HPC）在体外诱导分化为DC及其亚群1型常规DC（conventional type 1 DC,cDC1）;同时,从表型、关键转录因子及重要基因等几个方面,检测不同来源cDC1的差别;最终,为iPSCs来源cDC1在肿瘤免疫治疗的临床应用中,打下坚实基础。方法:（1）首先应用免疫荧光技术检测COX-2、CD163、CD206在肝癌患者组织切片中的表达情况,应用PCR技术检测肝癌患者组织标本中COX-2基因的表达水平,应用ELISA技术检测肝癌患者组织标本中PGE-2的含量;然后构建共培养模型,采用流式细胞术检测CD163和CD206在CD14+单核细胞上共培养前后的共表达情况,CD28、CD25、CD107A在CD8+T细胞活化前后的表达情况,活化后CD8+T细胞中颗粒酶B、IFN-γ在共培养前后的表达情况,此外,应用ELISA和流式检测技术,检测培养基中PGE2、TGF-β、颗粒酶、IFN-γ各细胞因子的水平,采用自动western技术检测Smad2,Smad3,pSmad2,pSmad3和FoxP1等TGF-β通路中相关蛋白的表达情况;最后构建体内动物模型,进行相应的验证。（2）应用诱导分化试剂盒或者现有的诱导分化培养基将iPSCs诱导为造血祖细胞,应用诱导分化试剂盒将原代造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）和iPSCs来源造血祖细胞诱导为CD14+单核细胞,应用GM-CSF、IL4和TNF-α将不同来源CD14+单核细胞诱导为成熟的DC细胞,应用Flt3L、SCF、GM-CSF、IL4等四个转录因子将不同来源的造血干/祖细胞诱导为cDC1。应用组织裂解试剂盒提取脾脏组织中原代DC及cDC1。应用慢病毒转染技术构建带有PU.1-IRF8-BATF3序列的iPSCs细胞系。应用流式细胞术分析造血干/祖细胞表面CD34/CD45的共表达水平,分析单核细胞表面CD14的表达水平,分析DC细胞表面CD11c/HLA-DR的共表达水平,分析cDC1表面CD11c、CD141/CLEC9A的表达水平,分析不同来源cDC1中5个关键转录因子的表达水平。应用普通转录组测序技术,分析脾脏来源原代DC、原代外周血CD14+单核细胞、原代CD14+单核细胞来源DC、原代造血干细胞来源单核细胞、原代造血干细胞来源DC细胞、iPSCs来源造血祖细胞等基因谱的表达。应用荧光素酶检测试剂盒及PCR相对荧光定量技术检测iPSCs细胞系是否构建成功。应用微量PCR相对荧光定量技术检测不同来源cDC1中31个重要基因的转录水平。结果:（1）HCC患者石蜡切片中COX-2的表达与M2型巨噬细胞标志物-CD163/CD206表达正相关,高表达COX-2的HCC细胞系可诱导人原代CD14+单核细胞向M2型巨噬细胞极化,HCC细胞系诱导的M2型巨噬细胞可以抑制激活后的CD8+T细胞产生IFN-γ和颗粒酶B,HCC细胞系诱导的M2型巨噬细胞通过TGF-β通路抑制激活后的CD8+T细胞产生IFN-γ和颗粒酶B。（2）外周血原代CD14+单核细胞可诱导为DC细胞,原代造血干细胞可诱导为CD14+单核细胞,并进一步诱导为DC细胞,iPSCs可诱导为造血祖细胞、CD14+单核细胞,并进一步诱导为DC细胞;测序结果显示:对比原代外周血CD14+单核细胞和原代CD14+单核细胞来源DC细胞这两组数据,LILRB2、AZI2、NLRP12、DCSTAMP、BATF3、SLAMF1这6种基因的变化有显著差异;对比原代造血干细胞来源单核细胞和原代造血干细胞来源DC细胞这两组数据,NLRP12、SLC11 A1、ZBTB46、TMEM176B、TMEM176A、TREM2、BATF3、DCSTAMP、SLAMF1、TRPM4、IRF8这11种基因的变化有显著差异;对比脾脏来源原代DC细胞和原代CD14+单核细胞来源DC细胞这两组数据,BCL3、TREM2、DCSTAMP这3种基因变化有显著差异。（3）脾脏中含有CD11clow CD141+CLEC9A+的原代cDC1细胞;在体外模型中,应用Flt3L、SCF、GM-CSF、IL4等四个细胞因子,可以将原代造血干细胞诱导分化至cDC1细胞;iPSCs来源的HPC诱导分化至cDC1的能力很差,相关转录因子的表达有着明显的缺陷。（4）在体外模型中,带有PU.1-IRF8-BATF3序列的iPSCs细胞系（统称为PIB细胞）可以被成功诱导为cDC1且相关转录因子的表达有着明显升高;同时,HSC来源的cDC1中呈递肿瘤抗原方面基因的转录水平更加突出,PIB来源的cDC1中启动CD4+T细胞,优化CD8+T细胞抗肿瘤免疫方面基因的转录水平更加突出。结论:（1）对于高表达COX-2的HCC患者,可以将选择性COX-2抑制剂作为佐剂,与细胞免疫疗法一起应用,从而降低肿瘤微环境对细胞毒性T细胞的抑制作用。（2）我们的体外诱导方案切实可行,可以将不同来源的造血干/祖细胞诱导为DC和DC中的cDC1亚群;同时,HSC来源的cDC1中呈递肿瘤抗原方面基因的转录水平更加突出,PIB来源的cDC1中启动CD4+T细胞,优化CD8+T细胞抗肿瘤免疫方面基因的转录水平更加突出。