诺如病毒(Noroviruses,NVs)是非细菌性肠胃炎的主要病原体,通过食品和水源传播可以引起全球范围的流行。流行病学调查提示双壳软体动物是NVs最主要的传播载体。近年来,由于生食含有NVs的贝类等水产品引发的世界范围的大规模肠胃炎疫情不断暴发,给消费者健康造成了巨大威胁,也给水产行业带来了重大损失。我国是贝类养殖大国,系统研究NVs的检测技术,建立贝类水产品中NVs快速灵敏的定性、定量检测方法,开展水产品中NVs污染状况流行病学调查,对于提供NVs检测技术,预防疫情暴发、减少渔业经济损失具有重要现实意义。NVs目前尚不能体外培养,变异多,鉴别和检测非常困难,传统的免疫学及血清学检测方法存在很大的局限性。逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)已经成为定性检测NVs的黄金法则,实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)、实时序列特异性核酸体外扩增(Real-time NASBA)等定量分子检测技术在病毒载量检测中已显示出越来越多的优势。根据诺如病毒RNA聚合酶区保守序列,优化了4对NVs引物的反应体系,筛选了最适合于贝类样品检测的引物为JV13I/JV12Y。并且以此引物作为定性检测方法,采用正交方法设计了9个实验组,充分考虑pH值、吸附剂和沉淀剂之间的交互关系,通过人工污染实验,筛选出了一种富集浓缩贝类中NVs最优方法,即在吸附缓冲液中性环境(pH 7.5)下,以苏氨酸作为吸附剂吸附两次,9%PEG6 000和7%的PEG8 000各沉淀一次,此法病毒回收率可达23%。以SYBR Green I为染料,以携带NVs基因片段的高纯质粒DNA作为标准质粒,通过改变信号收集温度,去除了大部分非特异性扩增的干扰,建立了检测贝类中NVs的实时荧光定量RT-PCR方法。当标准质粒量在108-103拷贝之间具有良好的线性关系,可以检测到10-5稀释度的病毒RNA,是常规RT-PCR法的100倍,方法操作简便,可以有效的节约时间、降低成本,取得较好的定量效果。使用TaqMan探针法,通过SP6酶体外转录成cRNA作为荧光定量的标准品,建立了一步法TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,简化了操作步骤,消除了样本处理与RT效率的不同对结果准确性造成的差异,能够最大限度提高贝类中NVs定量的可靠性,当cRNA标准品为108-102拷贝之间具有良好的线性关系,可以检测到10-6稀释度的病毒RNA,方法速度快,特异性好,为NVs快速准确定量提供了技术支持。自行设计了用于实时NASBA扩增反应的引物和分子信标,初步建立了基于LightCycler 2.0荧光定量仪的NVs实时NASBA检测方法,特异性好,灵敏度高于实时荧光定量RT-PCR方法,在cRNA标准品为108-100拷贝间标准曲线具有良好的线性关系。据我们所知,使用Roche LightCycler 2.0荧光定量仪进行NVs实时NASBA扩增的研究尚属首次。本研究表明,实验室可以使用Roche LightCycler 2.0实时定量仪可以代替特殊的扩增仪器成功的进行实时NASBA扩增。运用研究中建立的定性和定量检测方法,对2007年9月到2008年8月在山东半岛8个地区采集的186份贝类样品进行检测,从分子水平上初步分析了山东半岛地区贝类中NVs的污染状况和基因型别,结果有5份贝类检出NVs,冬季为高发季节,GGII-4型为贝类中NVs的主要类型,在一定程度上反映了我国沿海地区贝类中NVs污染状况,补充了我国水产品NVs污染状况数据,为开展全国性的NVs的风险评估和分子流行病学调查打下了基础。