【摘 要】
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腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的tte2635和tte2633基因分别被注释为cmr1和cmr4,属于CRISPR-CasⅢ-B亚型系统。前期研究发现腾冲嗜热厌氧杆菌在高温培养条件下CRISPR相关基因转录上调,CRISPR与嗜热机制的相关性研究尚未见报道,本论文为探究其嗜热机制进行了以下研究:1)嗜热菌中CRISPR结构特征分析。首先从Gen
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腾冲嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter tengcongensis）的tte2635和tte2633基因分别被注释为cmr1和cmr4,属于CRISPR-CasⅢ-B亚型系统。前期研究发现腾冲嗜热厌氧杆菌在高温培养条件下CRISPR相关基因转录上调,CRISPR与嗜热机制的相关性研究尚未见报道,本论文为探究其嗜热机制进行了以下研究:1)嗜热菌中CRISPR结构特征分析。首先从Gene Bank下载61株嗜热菌的全基因组,利用软件分析嗜热菌的CRISPR结构特征与嗜热程度之间的关系。结果发现61株嗜热菌中有59株含有CRISPR位点,其中CRISPRⅢ型系统占比最多为49.62%,嗜热菌的CRISPR位点平均长度、间隔序列平均数量关系为:一般嗜热菌>中等嗜热菌>极度嗜热菌,重复序列对应的RNA二级结构最小自由能、CRISPR位点平均数量关系为:极度嗜热菌>中等嗜热菌>一般嗜热菌。CRISPR位点平均长度、间隔序列平均数量与嗜热菌嗜热程度负相关,重复序列对应的RNA二级结构最小自由能、CRISPR位点平均数量与嗜热程度正相关,嗜热菌的CRISPR结构特征与嗜热程度存在相关性。2)cmr1、cmr4基因与腾冲嗜热厌氧杆菌的嗜热相关性分析与验证。PCR扩增cmr1和cmr4基因,构建原核表达载体p ET-28a::cmr1和p ET-28a::cmr4并在大肠杆菌BL21中表达Cmr1和Cmr4蛋白,生物信息学分析发现两种蛋白是亲水性蛋白,均没有跨膜结构。通过荧光定量PCR分析cmr1和cmr4在50℃、60℃、75℃和80℃下的转录水平,发现在50℃和60℃表达量低,在75℃和80℃表达量很高。表明这两种基因在高温条件下发挥着重要作用。利用同源重组构建cmr1和cmr4基因的缺失质粒,导入腾冲嗜热厌氧杆菌中构建缺失株Δcmr1和Δcmr4,在50℃、60℃、75℃和80℃条件下培养并绘制生长曲线,发现Δcmr1和Δcmr4在80℃不生长,在60℃、75℃条件下相比WT生长缓慢,50℃条件下三种菌株生长都十分缓慢,表明这两种基因编码的蛋白在腾冲嗜热厌氧杆菌热适应过程中发挥着作用。
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