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为研究Src激酶对PSD-95蛋白的磷酸化作用，并鉴定相应的磷酸化部位，提取鼠脑组织中的PSD-95(postsynaptic density protein 95)，并构建PSD-95-pcDNA3.1真核表达载体，使其在哺乳动物细胞COS-7中表达，分别通过体外激酶反应研究PSD-95是否可被Src激酶磷酸化；在COS-7细胞中分别表达PSD-95及其突变体的Myc融合蛋白：Myc-PSD-95、Myc-△G(去除PSD-95羧基端GK结构域)和Myc-△SG(去除PSD-95羧基端SH3和GK结构域)，通过体外激酶反应初步鉴定Src激酶介导下PSD-95酪氨酸磷酸化的部位
1．Sre激酶介导鼠脑组织中PSD-95的酪氨酸磷酸化
取大鼠海马，制备突触后密集区(PSD)，用抗PSD-95的抗体(anti-PSD-95)进行免疫沉淀。免疫沉淀物在ATP存在条件下与Src激酶在30℃反应30分钟后，用抗磷酸酪氨酸抗体(anti-pY)免疫印迹显示，Src能介导PSD-95蛋白的酪氨酸磷酸化。
2．PSD-95-pcDNA3.、Myc-PSD-95-pcDNA3.1及Myc-△G-pcDNA3.1真核表达载体的构建
采用RT-PCR法从大鼠海马中扩增出大鼠PSD-95的cDNA，克隆到peDNA3.1真核表达载体，经序列测定后证明与已发表的大鼠海马PSD-95序列完全一致。 以Myc-PSD-95-GW1(由Sheng M惠赠)为模板，利用PCR扩增出包含特定PSD-95序列的突变体Myc-△G。将Myc-PSD-95和Myc-△G基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，经限制性内切酶酶切和测序结果证实扩增出的突变型PSD-95基因亦完全正确。
3.野生型／突变型PSD-95重组质粒在COS-7细胞中获高效表达
经鉴定序列完全正确的野生型／突变型PSD-95重组体用脂质体介导法转染到COS-7细胞系中。用高糖DMEM培养基培养24-48h，收集细胞，分别用anti-PSD-95以及anti-c-Myc抗体进行免疫印迹分析，可见PSD-95-pcDNA3.1、Myc-PSD-95-pcDNA3.1、Myc-△G-pcDNA3.1、Myc-△SG-pcDNA3.1组均可检测到相应的蛋白质条带。结果表明，野生型和突变型PSD-95重组质粒在COS-7细胞中均获得了高效表达。
4.Src介导Myc-PSD-95及Myc-△G的酪氨酸磷酸化，对Myc-△SG没有磷酸化作用
分别收集转染24.48h的COS-7细胞，超声破碎后按Lowry法测定蛋白质含量。分别用anti-PSD-95以及anti-c-Myc抗体进行免疫沉淀，经洗涤后收集沉淀样品，加入ATP、Src激酶，30℃反应30min。用anti-pY抗体免疫印迹显示，Src能介导PSD-95、Myc-PSD-95以及Myc-△G的酪氨酸磷酸化，Myc-△SG没有发生磷酸化反应。
结论：
1.成功地克隆出野生型／突变型PSD-95真核表达重组质粒：PSD-95-pcDNA3.1、Myc-PSD-95-pcDNA3.1、Myc-A G-pcDNA3.1。
2.PSD-95、Myc-PSD-95、Myc-△SG、Myc-△G蛋白在哺乳动物细胞COS-7中高效表达。
3．Src能介导。PSD-95的酪氨酸磷酸化。
4．PSD-95的SH3结构域中存在酪氨酸磷酸化位点，但不排除GK结构域中存在酪氨酸磷酸化位点的可能。