骨碎补干预骨髓间充质干细胞对兔关节软骨修复的实验研究

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目的:1.骨碎补干预骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导。2.观测兔软骨细胞-FN/PLGA/TGF-β1生物支架复合体对兔膝关节软骨缺损修复的实验研究。  方法:1.进行兔骨髓间充质干细胞的体外培养,通过形态学观察、FCM检测及甲苯胺蓝染色进行鉴定;2.最佳浓度骨碎补干预兔 BMSCs向软骨细胞转化,通过 MTT法对细胞活性的检测、免疫组化对Ⅱ型胶原的测定及甲苯胺蓝染色检测GAG的合成等方法观察体外培养的兔BMSCs增殖分化的情况,并以此得到软骨细胞;3.将聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)生物支架切成4mm*4mm*4mm大小,消毒,将诱导好的第2代软骨细胞以4×1010/L体外接种于PLGA生物支架上,体外培养7天,观察细胞在支架内的生长情况、形态及吸附、分布情况;行HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色,观察软骨细胞数量、形态及Ⅱ型胶原含量,并利用图像分析软件对Ⅱ型胶原免疫组化染色面积进行分析;4.将细胞-支架复合物植入兔膝关节软骨缺损处,分别在4周,8周,12周取样,观察细胞-支架复合物对软骨缺损的修复情况。  结果:1.①兔BMSCs成均匀分布的簇状生长、形态梭形。在传代培养中形态特性无明显变化、均质性提高,高表达CD44,不表达CD34,可证明为非造血干细胞。②骨碎补可以诱导兔BMSCs向软骨细胞分化,诱导后的细胞能分泌细胞外基质,例如Ⅱ型胶原蛋白,用组织学检查及Ⅱ型胶原抗体免疫荧光检测证实骨髓间充质干细胞已转化为软骨细胞。2.①HE染色对照组支架纤维组织有所增加,未见成软骨细胞和软骨组织,支架被少许骨基质及纤维组织填充;试验组支架降解成网状并被吸收,成软骨区圆形、椭圆形、多边形成软骨细胞及细胞间质逐渐增多,生成少量软骨组织,并见少量多核的破骨细胞及软骨基质;空白组仅见少量淋巴细胞和纤维细胞,未见软骨细胞。②Ⅱ型胶原染色细胞支架组软骨区域PLGA生物支架逐渐降解减少,Ⅱ型胶原染色阳性逐渐增强,类软骨样组织逐渐增多,术后12周后可见少许类软骨样组织;对照组和空白组术后Ⅱ型胶原染色均为阴性。③甲苯胺蓝染色细胞支架组术后4至8周甲苯胺蓝染色阳性逐渐增强,细胞核外类软骨样组织逐渐增多,术后12周有类软骨样组织生成;对照组和空白组各检测周期甲苯胺蓝染色阴性。3.电镜扫描细胞支架组成软骨区可见大量圆形、椭圆形软骨细胞;对照组扫描电镜下表面较粗糙,孔隙较多,大小不一,孔隙间多有交通,未发现软骨细胞;空白组电镜下未发现软骨细胞生成。  结论:1.通过体外对兔BMSCs的分离培养与鉴定,可建立较完善的BMSCs培养体系;骨碎补各组与阳性对照组相比诱导作用弱,但与空白组比较有阳性意义。2.纤维粘连蛋白修饰的PLGA支架具有良好的亲水性,更适合软骨细胞贴附生长以及Ⅱ型胶原的合成。3.软骨细胞-FN/PLGA/TGF-β1复合体修复软骨缺损具有可行性,在软骨组织缺损修复中具有较大的应用前景。
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