骨骼疾病是常见的疾病之一。目前发现的骨骼遗传病多达100余种,骨骼肌肉遗传病发病率位居所有出生缺陷病的第二位,是影响生殖健康的重要因素之一。骨骼退行性和代谢性疾病十分普遍,尤其是在高龄人群中,几乎都患有不同程度的骨性关节炎、骨质疏松[1,2]。各种原因导致的骨折更是屡见不鲜。美国每年仅花在治疗骨质疏松所致骨折上的费用就高达140亿美元。成纤维细胞生长因子FGF（Fibroblast growth factor,FGFs）及其受体参与多种组织、器官发育和修复过程,是目前研究的热点。到目前为止在哺乳动物中已发现FGFs家族的23个成员,其分子信号都是通过其带有酪氨酸激酶活性的成纤维细胞生长因子受体FGFRs（fibroblast growth factor receptors,FGFRs）传入细胞的。FGFs/FGFRs作用广泛,近年来大量研究发现FGF信号与骨骼发育及相关疾病有着密切关系。已明确的FGFR有四种:FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4,其中FGFR3是在骨骼发育中发挥重要作用的受体之一[3,4]。FGFR3是FGFRs家族成员之一,FGFR3主要在生长板软骨表达,在成骨细胞也有少量表达,它是骨骼生长的负性调节分子。近年来发现FGFR3的多种功能增强型突变可直接和间接（抑制可刺激软骨细胞增生的IHH）导致软骨细胞增生活性降低,对人类可导致几种类型的软骨发育不良[5,6,7],包括软骨发育不全（achondroplasia, ACH）、季肋发育不全（hypochondroplasia, HCH）和致死性骨发育不全（thanatophoric dysplasia, TD）等软骨发育不良性疾病。而FGFR3基因敲除小鼠则表现出骨骼过度生长,皮质骨变薄,骨质减少（Osteopenia）（骨质疏松）,易于骨折等症状,且培养的原代MSCs形成钙化结节的数量较野生小鼠的少,这些现象提示FGFR3在骨骼发育以及成年期骨骼稳定性的维护中起重要作用。由于骨折修复过程与骨骼发育间在分子及细胞、形态发生过程间有相似性（均由膜内成骨和软骨内成骨两个过程交织进行来完成）,提示FGFR3在骨折修复过程中也有作用[8,9,10]。事实上,既往研究已发现FGFR3可促进骨折的膜内成骨过程。基于FGFR3在骨骼发育及疾病过程中的作用,提示通过调节FGFR3的活性来促进骨骼发育和治疗骨骼疾病,可加快骨折愈合速度,防治骨不连或不愈合。理论上讲,能调节FGFR3的手段较多,包括基因治疗、直接应用重组的FGFs等,但前者存在安全性差及诱导免疫反应的缺点,而直接应用FGFs则费用高昂,且目前还没有与FGFR3完全特异结合的FGFs,即使用FGFs可能会引起其它FGFRs如FGFR1、FGFR2等的活性变化。且FGF/FGFR有促肿瘤血管形成作用,因此也存在风险性。利用噬菌体展示肽库技术可从随机肽库中筛选到能和FGFR3结合的短肽。与FGFR的天然配体FGFs相比,短肽具有免疫原性小、特异性高、合成条件易于实现、给药途径多等优势。本课题利用噬菌体展示技术,以具有天然活性和空间构象的FGFR3蛋白为靶标从噬菌体随机12肽库中筛选与FGFR3具有较高亲和力的多肽,并从分子水平、细胞水平以及组织水平对多肽P1,P2的生物学活性进行了分析验证。研究结果如下:1.经过三轮筛选,噬菌体得到了有效富集,噬菌体的回收率由第一轮的2.24×10-7pfu增加到4.8×10-3pfu;ELISA测定结果显示所筛选的噬菌体单克隆与FGFR3具有较高亲和力;竞争抑制实验表明筛选出的噬菌体与FGFR3的结合可被天然配体bFGF竞争抑制;挑选45个噬菌体单克隆进行DNA测序,翻译成氨基酸序列后发现16种多肽序列,其中呈现序列P1:VSPPLTLGQLLS的噬菌体单克隆有22个,其余大部分序列与P1具有高度同源性,同源序列为TLGxLL（x表示任意氨基酸残基）;2.细胞增殖活性检测发现,P1对FGFR3表达阳性细胞ATDC5和C3H10T1/2的增殖具有促进作用,P2对这两种细胞的增殖无明显作用;定量PCR对几种软骨细胞分化标志基因表达进行检测,发现P1对ATDC5细胞向软骨细胞分化以及肥大的的过程表现为促进作用,P2促进ATDC5细胞向软骨细胞分化,却使其进一步向肥大细胞分化延迟;定量PCR检测发现,P1,P2都能增强ATDC5细胞中FGFR3的表达,P2还同时增强FGFR1的表达,但二者均不引起FGFR2表达水平的变化;建立了胎鼠胫骨跖骨体外培养模型,发现P1对ACH基因型胎鼠的跖骨生长具有明显促进效果,对野生型胎鼠跖骨生长也有一定促进作用;Western Blotting检测多肽处理后ATDC5细胞中MAPK和PI3K两条信号通路的信号分子活化水平,结果显示,P1,P2对MAPK信号通路中ERK1/2分子磷酸化水平具有明显上调作用,对p38分子的磷酸化水平有明显的下调功能,而对JNK分子和PI3K/AKT信号通路中AKT分子的磷酸化水平无明显作用。主要结论:1.从噬菌体随机12肽库中筛选出的阳性噬菌体单克隆及其呈现的相应多肽与FGFR3均具有较高亲和力。多数阳性克隆的氨基酸序列具有较高同源性,其主要公共序列为:TLGxLL（x表示任意氨基酸残基）。该结果提示,TLG-LL极可能是这些多肽与FGFR3结合的关键位点。2.多肽P1、P2通过调节FGFR3的表达水平及其下游信号分子的活性对骨细胞的增殖与分化产生影响,有促进骨发育的功能,有望开发成为防治FGFR3功能异常性疾病的多肽药物。