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水稻条纹病毒(Ricestripevirus,RSV)引起水稻条纹叶枯病,在我国江苏、浙江和云南等省份的水稻种植区普遍发生,导致水稻40-50%的减产.RSV造成水稻叶片出现条纹症状,严重时发生心叶枯死和分蘖减少,RSV是纤细病毒属(Tenuivirus)的代表成员,为负义链RNA病毒,其基因组由4条单链RNA组成,采用双义编码策略,编码7个不重叠的阅读框.RSVRNA3编码的p3蛋白是RNA沉默抑制子,在病毒侵染中起重要作用.目前有关p3基因的变异及其在植物中的作用是有关RSV的研究热点,但其具体作用及其机制仍不清楚. 为深入探讨RSVp3基因的变异并获得其抗血清,本研究采用RT-PCR技术克隆了四川省RSV分离物的p3基因,利用MEGA5.0构建其发育进化树,进行系统进化分析;将其该基因克隆到原核表达载体pET-32a上,构建重组质粒pET-32a/p3转化大肠杆菌BL21pLysS,经IPTG诱导后纯化蛋白,免疫家兔获得其多克隆抗体,效价为1∶2000.结果表明,本研究从四川省会东县水稻种植区采集了13份表现条纹、黄化和卷曲症状的水稻病叶,利用RSVCP的单克隆抗体对其进行了斑点免疫ELISA(Dot-ELISE)检测,结果从13份样品中有9份样品检测到RSV.提取阳性样品总RNA,利用RSVp3基因特异性引物经RT-PCR扩增获得636nt的片段.系统进化分析显示四川分离物Huid04(KX611339)与云南分离物KunM08(JQ927423)和DaL08(JQ927420)的核苷酸相似性最高,分别为96.86%和97.01%,具有较近的亲缘关系. 本实验室前期研究发现转p3水稻对稻瘟病(riceblastdisease,Magnaportheoryzae)和水稻白叶枯病(bacterialblight,Xanthomonasoryzae)有一定的抗性;RSV侵染转p3本氏烟时,与野生型相比转基因本氏烟中病毒积累量更少,几乎没有病毒症状.为了探究p3基因在本氏烟植株体内的功能,本研究以转p3本氏烟和野生型本氏烟为材料,采用Trizol法提取本氏烟的总RNA,进行转录组测序.结果p3基因在本氏烟中表达后一共有2533个差异表达基因(筛选条件,以茄科为参考基因组p值≤0.05并且差异倍数|log2Foldchange|≥1),其中有597个基因上调的,有1936个基因下调.这些差异基因聚合于43个GO功能大类和59条KEGG通路,其中主要的通路是核糖体(ko03010),光合作用(ko00195),光合作用天线蛋白(ko00196)和碳代谢(ko01200),这4条通路中每个通路都有超过80个的差异表达基因聚集.在转录组测序结果中选择了12个差异表达基因进行RT-qPCR验证转录组结果,验证结果与转录测序结果相一致. 在上述4个关键通路和差异倍数大于2的差异表达的基因中,筛选后得到了10个与核染色体、抗性基因、光合作用途径和能量代谢途径等预测功能有关的基因.为明确p3本氏烟转录组中的候选差异表达基因的功能,我们利用烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)介导的基因沉默(Virus-inducedgenesilencing,VIGS)技术和马铃薯X病毒(PotatovirusX,PVX)介导的基因过表达技术来验证基因对症状形成的作用.结果发现TRV介导组蛋白相关基因(3.NbHis-2,4.NbHis-3,5.NbHis-5)的沉默会引起叶片皱缩畸形或褪绿,而这些基因造成的症状具有不同程度的皱缩或褪绿.无论是过表达还是沉默分析与热激转录因子相关的基因(2.NbHSFP),结果均表明该基因与褪绿或绿斑驳症状形成相关.TRV介导能量代谢有关的基因(1.NbATP-2和13.NbOLA-2)的沉默之后分别出现不同程度的新叶卷曲、畸形和黄脉.TRV介导抗性基因(8.NbLRR-2)的沉默,引起了严重的新叶卷曲和畸形.沉默光合作用系统Ⅰ的组成装备相关基因(19.NbPSB-2和21.NbPSB-4),病毒症状与对照无明显差异.过表达硫氰酸酶相关基因(23.NbRLD-2)后,植株叶片表现出绿斑驳症状. 综上所述,本研究在四川省会东县发现疑似感染RSV的水稻,结果发现RSV在四川会东县水稻上发生危害;对RSV四川分离物p3进行了进化分析发现,其与云南分离物的亲缘关系较近;对RSV四川分离物p3进行原核表达,制备了可检测p3蛋白的多克隆抗体;对转p3本氏烟进行转录组分析,结果发现p3基因表达影响了本氏烟内源基因表达;对10个差异基因进行沉默和过表达分析,结果发现这些基因影响本氏烟的正常生长.