[目的]丙型肝炎病毒（HCV）是一种有包膜的正链RNA病毒,是黄病毒科肝炎病毒属的唯一成员。因其感染人数庞大和可能导致的严重后果,HCV感染已成为全球性的健康问题。piRNA（Piwi-interactiing RNA）是一类长度约为24～32nt的小非编码RNA,通过与PIWI蛋白相互作用调控靶基因的表达。然而,在HCV感染过程中piRNA的表达谱特征仍然未知。本研究旨在通过对HCV感染的人肝癌细胞Huh7.5.1的小RNA组学分析,揭示HCV感染细胞的piRNA表达谱特征,筛选差异表达的piRNA并分析其潜在的生物学功能,为认识HCV感染导致的肝脏疾病的分子机制提供新的线索。[方法]从GEO数据库下载HCV感染的人肝癌细胞Huh7.5.1的小RNA测序数据集GSE74014。首先利用多种软件对原始数据进行质控,确保数据可靠性。随后对质控过滤后的有效数据进行一系列生物信息学分析,包括参考基因组比对,miRBase及piRBase数据库比对注释等,得到已知piRNA并进行长度分布和碱基偏好性统计。随后采用TPM（transcript per million）计算已知piRNA表达量,进而比较HCV感染样本和对照样本的piRNA表达差异。根据差异表达piRNA筛选标准:Fold Change值大于等于2(或（|log2FC|大于等于1）且p值小于0.05,筛选显著性变化的piRNA。然后使用Miranda软件预测差异piRNA的靶基因,并通过GO和KEGG富集分析对预测靶基因进行基因本体和通路分析,进一步寻找具有潜在研究价值的差异piRNA。[结果]小RNA测序数据集GSE74014经质控过滤后,对照组和实验组各样本的有效数据量（Clean Reads）分布在9.0-16.02M,与参考基因组比对率分布在87.39-91.95%,并且小RNA长度分布均呈22nt处单峰,提示数据可靠。经piRBase数据库比对注释的已知piRNA长度分布在15-32nt,并呈现双峰,峰值分别在18nt和25nt处。已知piRNA的首位碱基具有明显的尿嘧啶偏好性。对已知piRNA表达量进行可视化,提示组内样本表达模式相似度高,而组间样本表达相似度低,证明对照组与实验组样本的piRNA表达量具有可比性。piRNA表达差异分析显示,与对照组相比,HCV感染Huh7.5.1细胞7天后差异表达的piRNA总数为87个,其中显著性上调的piRNA有63个（log2FC>1,P<0.05）,显著性下调的piRNA 有 24 个（log2FC<-1,P<0.05）。此外,HCV 感染诱导了 Huh7.5.1 细胞中piR-hsa-23821 及 piR-hsa-11817 的表达,同时抑制了 piR-hsa-28522 及piR-hsa-32260的表达。GO和KEGG功能富集分析提示,差异piRNA靶基因主要富集在转录,转录调控及信号转导的生物学过程,参与了多条肿瘤相关的通路,脂质代谢通路和免疫通路。[结论]与未感染的对照细胞相比,HCV感染Huh7.5.1细胞后导致了87个piRNA的差异表达,其中显著性上调的piRNA有63个,显著性下调的piRNA有24个。我们发现了2个被HCV诱导的piRNA（piR-hsa-23821,piR-hsa-11817）和2个被HCV 完全抑制的 piRNA（piR-hsa-28522 和 piR-hsa-32260）。这些差异表达 piRNA的靶基因功能富集分析提示,它们可能在HCV感染及肝癌细胞增殖相关的代谢紊乱和肝脏疾病中发挥重要作用,有待进一步研究。[目的]寨卡病毒（Zikavirus,ZIKV）是虫媒黄病毒之一,ZIKV感染不仅会引起自限性症状,还可能导致包括小头畸形和格林-巴利综合征在内的神经系统疾病和自身免疫性并发症。历史上已多次爆发ZIKV大流行,该病毒仍持续威胁着人类生命健康。但是由于各种原因,目前尚无批准上市的疫苗可用于预防ZIKV感染。我们需要研发一种安全有效的疫苗,以应对中国在未来可能要面对的ZIKV疫情。本研究旨在对本课题组己构建的一种新型重组寨卡疫苗进行免疫学初步评价,包括免疫原性评价和有效性评价准备。此重组寨卡疫苗以T7噬菌体为疫苗载体,以与登革病毒无交叉的ZIKV包膜蛋白第HI结构域（EDⅢ）为疫苗设计靶点,重组噬菌体能够在表面展示ZIKV EDⅢ蛋白从而诱导机体免疫反应。本研究对重组寨卡疫苗进行免疫学初步评价,将有利于推进这种经济有效的新型寨卡疫苗的研发。[方法]本研究利用课题组保存的重组噬菌体作为疫苗种子,成功复苏并经PCR鉴定后,进一步扩大培养。鉴定成功的重组噬菌体在对数生长期的宿主菌大肠杆菌BLT5403中快速增殖,再经PEG8000沉淀及高速离心后可得到纯化的噬菌体。将采用双琼脂夹心法测定滴度达到5x109pfu/ml的噬菌体经甲醛灭活后,制成疫苗待用。以109pfU的免疫剂量经腹腔注射免疫6-8周龄的BALB/c雌性小鼠,并在首次免疫后第二周加强免疫,设置空载噬菌体组和EDID蛋白组作为对照并进行相同的免疫程序。首次免疫后第1、4、8、12、16、20、24周,采集并分离小鼠尾静脉血清,利用ELISA间接法检测免疫血清中特异性抗-EDⅢIgG的水平。首次免疫后第9周采集小鼠眼球血并处死,取小鼠脾脏进行ELISPOT实验,检测免疫后小鼠脾细胞分泌的IL-4和IFN-Y,以评价寨卡疫苗诱导细胞免疫的水平。分别采用CCID50法和qPCR绝对定量法测定经浓缩的寨卡病毒的滴度和病毒载量。[结果]成功复苏本课题组保存的重组噬菌体,37℃培养4-6h可形成噬菌体空斑。经PCR鉴定正确的重组噬菌体,在宿主菌中扩大培养至滴度为5x109pfu/ml,甲醛灭活后成为待用疫苗。以较低剂量（109pfU）且不添加佐剂的重组寨卡疫苗免疫BALB/c小鼠后,能诱导其产生特异性抗EDⅢIgG抗体。从首次免疫后第4周开始检测到几何平均滴度为1:400的抗体,之后抗体水平上升,在第8周达到峰值1:975.21,此后抗体水平呈现小幅度的波动,直到首次免疫后第24周,重组疫苗诱导的抗体滴度保持在1:883.27。在小鼠首次免疫后第9周进行ELISPOT实验,结果显示,经重组寨卡疫苗免疫的小鼠的脾细胞经EDE3蛋白刺激后,检测到细胞因子IL-4和IFN-y的分泌,且未刺激孔的斑点数小于经EDⅢ蛋白刺激孔的斑点数。two-way ANOVA的方差分析显示刺激和未刺激因素对于斑点数的影响有统计学意义（IL-4,p=0.0180;IFN-y,p=0.0123）,但是进一步两两比较（Multiple comparisons）后,每两个组的p值均大于0.05,意味着重组疫苗组与空载噬菌体组、EDⅢ蛋白组之间没有显著性的差异,提示重组寨卡疫苗不能明显诱导细胞免疫应答。在对重组寨卡疫苗有效性和保护性评价的准备中,成功在C6/36细胞中扩增ZIKV并浓缩,得到的病毒液经PCR及测序鉴定正确,并测定其滴度为103313 CCID50ml,病毒载量为4.211×1011copies/ml。成功构建标准曲线用于qPCR绝对定量法测定ZIKV病毒载量,其标准方程为y=-4.1898x-59.528。[结论]较低剂量（109pfU）且不添加佐剂的重组寨卡疫苗免疫BALB/c小鼠后,以诱导体液免疫应答为主,能诱导其产生特异性抗EDⅢIgG抗体,而不能明显诱导细胞免疫应答。已测定滴度及载量的寨卡病毒浓缩液,可用于后续有效性评价。