论文部分内容阅读
二倍体马铃薯原始栽培种具有多种抗性基因,紫色马铃薯富含花青素且具有较高的营养价值和药用价值,两者均是马铃薯品种改良的重要基因库,也是体细胞杂交育种的优质材料。实验以马铃薯原始栽培种“NDK47-33”、“NDK5-19”及紫色马铃薯“GSAP-H”为材料,探讨了稳定的悬浮细胞原生质体解离、纯化、培养及融合体系,并研究了“GSAP-H”愈伤组织花青素含量在试管微环境条件下的变化以及原生质体细胞系的花青素含量变化。实验获得了如下结果:1.以马铃薯试管苗茎叶为外植体进行愈伤组织诱导,其最佳诱导培养为MS+2.0 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D;在此培养基中,愈伤组织诱导频率高达100%。愈伤组织的最佳继代培养基为MS+1.0 mg/L NAA+2 mg/L 2,4-D+250 mg/L CH。经过3次连续继代培养的愈伤组织生长旺盛,结构疏松,是建立悬浮细胞系的最适材料。2.三种马铃薯品系“47-33”、“5-19”和“GSAP-H”的悬浮细胞均在MS+1.0 mg/L NAA+2mg/L 2,4-D+250 mg/L CH的液体培养基,24℃,120 r/min摇动培养下繁殖力最强,生理状态最好,最佳继代时间为4 d,最多连续培养6代。3.继代培养4次的“GSAP-H”悬浮细胞在2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.25%离析酶+0.3 M蔗糖的酶解液中,于26℃、80 r/min的摇床转速下酶解14 h,获得的原生质体产量和活力最高(8.17×106个/g·FW,95%)。4.液体浅层培养法利于原生质体的分裂,在0.5 mg/L BAP+2.0 mg/L 2,4-D VKM培养基中,起始密度位2.5×105个/ml,“GSAP-H”悬浮细胞原生质体培养2~3 d出现一次分裂,10 d左右二次分裂,30~40 d形成小细胞团,植板率高达31.46%。在MS+1.0 mg/L ZT+1.0 mg/L BAP+0.1 mg/L NAA+2 g/L AC+1%甘露醇的分化培养基中,小细胞团培养50~60 d可再生完整植株。随机检测36个原生质体细胞无性系,花青素含量在8.464~4477.44 nmol/g·FW之间变动;实验共获得23个原生质体植株。5.在25%PEG 6000浓度下,“GSAP-H”与“NDK47-33”悬浮细胞原生质体融合15 min的总融合频率和2~3细胞融合频率最高,分别为52.24%,42.84%。而两者在112 V/cm交变电场强度,10 s交流电作用时间,脉冲宽幅为50 us,直流脉冲强度为2240 V/cm,脉冲2次的电融合条件下,融合效果最好,总融合频率和2~3细胞融合频率可达62.15%,49.34%。6.试管微环境对马铃薯“GSAP-H”愈伤组织花青素含量具有影响。在1.5 mg/L 2,4-D和1.0mg/L NAA浓度下花青素含量最高,分别为863.15和880.65 nmol/g·FW;高浓度BAP不利于愈伤组织的生长,但花青素含量在4 mg/L BAP下达到高峰,为848.745 nmol/g·FW。蔗糖是花青素生产的最好碳源,45 g/L蔗糖下的愈伤组织生长最快且花青素含量最高(887.035nmol/g·FW);培养基中NO3-与NH4+比例为3:1时,愈伤组织花青素含量最高(895.54nmol/g·FW)。此外,全光照利于花青素产量的提高。p H 4.8及25℃的培养条件可明显促进愈伤组织花青素的积累。