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花生是我国产量丰富的经济作物,其副产物花生壳绝大部分被焚烧丢弃,极少部分再加工利用,造成资源的浪费。研究表明花生壳富含黄酮、多酚等化合物,具有抗菌作用,但抗菌组分和机理还不明确。本研究针对花生壳提取物开发为食品天然防腐剂存在的问题,通过花生壳提取物分离纯化和抗菌活性跟踪检测的基础上,确定其主要抗菌组分和对金黄色葡萄球菌的抗菌机理。主要研究结果如下:
1、花生壳分级提取物抗菌活性和稳定性的测定
采用滤纸片等法测定不同极性溶剂花生壳分级提取物对食品中常见的致病菌和腐败菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 12900)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 43889)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC 13076)的抗菌活性,并对提取物抗菌活性的稳定性进行研究。结果表明:花生壳分级提取物对供试菌均有一定的抑制作用,其中花生壳乙酸乙酯提取物(EAPH)对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强,其最低抑制浓度(MIC)和最低致死浓度(MBC)分别为0.78mg/mL和3.13mg/mL。EAPH的抗菌活性具有良好的热稳定性,在中性或者弱酸性环境中活性较稳定,不耐碱性环境,不耐长时间的紫外辐射,且不同金属离子对花生壳乙酸乙酯提取物抗菌作用有显著差异,Cu2+、Fe2+、Al3+可增强其抗菌活性,Mg2+、K+、Mn2+可降低其抗菌活性。
2、花生壳乙酸乙酯提取物的分离纯化与主要抗菌成分的确定
采用柱层析法对EAPH进行分离纯化,各纯化组分以金黄色葡萄球菌为研究对象进行抗菌活性跟踪检测,确定主要抗菌组分。结果表明:不同花生壳分级提取物多酚含量:花生壳乙酸乙酯提取物(EAPH)>花生壳无水乙醇提取物(EEPH)>花生壳水提物(WPH)>花生壳三氯甲烷提取物(TMPH)>花生壳石油醚提取物(PEPH),其中EAPH、EEPH多酚含量分别为4.61%、3.32%,显著高于其他分级提取物。主要抗菌组分存在于EA-4-3中,液相质谱分析确定其中主要抗菌活性物质为木犀草素,其中花生壳乙酸乙酯提取物中木犀草素含量4.53mg/g,EA-4中木犀草素含量43.6%,再次纯化后的EA-4-3中含量上升至78.3%。
3、花生壳乙酸乙酯提取物和EA-4-3对金黄色葡萄球菌抗菌机理的研究
通过EAPH和EA-4-3对金黄色葡萄球菌的生长曲线、菌体培养液电导率、胞外核酸和蛋白、生物膜形成以及菌体形态等方面研究抗菌机理。结果表明:EAPH和EA-4-3对金黄色葡萄球菌的生长和繁殖具有显著的抑制作用,导致延滞期延长、生长速率下降;胞外电导率、蛋白以及核酸均有不同程度的增大;菌体生物膜形成能力也受到了抑制;通过电镜观察,细胞形态发生明显的破裂、畸形,且随着浓度的增大,破损程度越明显。
本研究通过不同极性溶剂对花生壳进行分级提取和分离纯化,跟踪抗菌实验,首次明确了花生壳提取物的主要抗菌活性物质为木犀草素,并明确其抗菌机理为扰乱了菌体的正常生长周期,改变膜的通透性,破坏细胞膜、细胞壁的完整性使胞内大分子泄露,从而影响菌体物质的合成、正常能量的代谢及信息的传递。
1、花生壳分级提取物抗菌活性和稳定性的测定
采用滤纸片等法测定不同极性溶剂花生壳分级提取物对食品中常见的致病菌和腐败菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 12900)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 43889)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC 13076)的抗菌活性,并对提取物抗菌活性的稳定性进行研究。结果表明:花生壳分级提取物对供试菌均有一定的抑制作用,其中花生壳乙酸乙酯提取物(EAPH)对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强,其最低抑制浓度(MIC)和最低致死浓度(MBC)分别为0.78mg/mL和3.13mg/mL。EAPH的抗菌活性具有良好的热稳定性,在中性或者弱酸性环境中活性较稳定,不耐碱性环境,不耐长时间的紫外辐射,且不同金属离子对花生壳乙酸乙酯提取物抗菌作用有显著差异,Cu2+、Fe2+、Al3+可增强其抗菌活性,Mg2+、K+、Mn2+可降低其抗菌活性。
2、花生壳乙酸乙酯提取物的分离纯化与主要抗菌成分的确定
采用柱层析法对EAPH进行分离纯化,各纯化组分以金黄色葡萄球菌为研究对象进行抗菌活性跟踪检测,确定主要抗菌组分。结果表明:不同花生壳分级提取物多酚含量:花生壳乙酸乙酯提取物(EAPH)>花生壳无水乙醇提取物(EEPH)>花生壳水提物(WPH)>花生壳三氯甲烷提取物(TMPH)>花生壳石油醚提取物(PEPH),其中EAPH、EEPH多酚含量分别为4.61%、3.32%,显著高于其他分级提取物。主要抗菌组分存在于EA-4-3中,液相质谱分析确定其中主要抗菌活性物质为木犀草素,其中花生壳乙酸乙酯提取物中木犀草素含量4.53mg/g,EA-4中木犀草素含量43.6%,再次纯化后的EA-4-3中含量上升至78.3%。
3、花生壳乙酸乙酯提取物和EA-4-3对金黄色葡萄球菌抗菌机理的研究
通过EAPH和EA-4-3对金黄色葡萄球菌的生长曲线、菌体培养液电导率、胞外核酸和蛋白、生物膜形成以及菌体形态等方面研究抗菌机理。结果表明:EAPH和EA-4-3对金黄色葡萄球菌的生长和繁殖具有显著的抑制作用,导致延滞期延长、生长速率下降;胞外电导率、蛋白以及核酸均有不同程度的增大;菌体生物膜形成能力也受到了抑制;通过电镜观察,细胞形态发生明显的破裂、畸形,且随着浓度的增大,破损程度越明显。
本研究通过不同极性溶剂对花生壳进行分级提取和分离纯化,跟踪抗菌实验,首次明确了花生壳提取物的主要抗菌活性物质为木犀草素,并明确其抗菌机理为扰乱了菌体的正常生长周期,改变膜的通透性,破坏细胞膜、细胞壁的完整性使胞内大分子泄露,从而影响菌体物质的合成、正常能量的代谢及信息的传递。