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目的基于前期实验结果葡萄糖对细胞存活发挥重要作用,本研究主要目标是通过探究索拉非尼（Sorafenib,Sora）联合不同葡萄糖限制方式对肝癌细胞及裸鼠移植瘤的影响来阐明线粒体自噬在其中起到的作用,为进一步研究临床上提出将肝动脉化疗栓塞（Transcatheter hepatic arterial chemoembolization,TACE）和索拉非尼联合治疗的方案提供研究方向和临床指导意见。方法（1）索拉非尼联合营养缺乏的体外实验模型的建立:使用不同营养素缺失的培养基联合索拉非尼处理肝癌细胞,检测索拉非尼结合哪种营养成分缺乏对细胞死亡更为敏感。后面的实验将建立在这个敏感的培养基和索拉非尼的联合处理上。（2）细胞生长和死亡实验:使用碘化丙啶（Propidium iodide,PI）活染,细胞周期检测sub G1,测定乳酸盐脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）的释放率和克隆形成实验等方法检测各实验组对肝癌细胞存活及死亡情况的影响。（3）线粒体功能和活性实验:使用H2DCFDA（DCF）和Mito SOX Red Mitochondrial Superoxide（Mito SOX）试剂分别检测活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS）和线粒体ROS的产生情况;使用四甲基罗丹明甲酯（Tetramethylrhodamine methyl,TMRM）和JC-1染色检测线粒体膜电位;使用腺苷三磷酸（ATP）试剂盒直接检测细胞内ATP的含量;使用Seahorse能量代谢仪检测线粒体耗氧率。（4）线粒体自噬实验:使用蛋白质印迹法（Western blot,WB）检测细胞内相关蛋白含量变化;通过检测线粒体脱氧核糖核酸（mt DNA）染色情况和m Keima的荧光改变情况检测线粒体自噬发生与否;使用特异小干扰RNA（si RNA）对线粒体自噬相关的重要基因进行沉默,确定其是否起关键作用。（5）裸鼠移植瘤实验:待移植瘤长到50mm~3左右后,将裸鼠随机分成四组:对照组（生理盐水）、索拉非尼组（20 mg/kg）、卡格列净组（Canagliflozin,cana,30 mg/kg）和卡格列净联合索拉非尼组,对各组裸鼠进行隔天灌胃处理。两周后人道处死小鼠并收集肝癌移植瘤。通过凋亡细胞原位末端标记（Terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）染色、苏木精伊红（Hematein＆eosin,HE）染色和Ki-67免疫组织化学分别检测肿瘤细胞的死亡和增殖情况。结果（1）通过不同营养素缺失的培养基联合索拉非尼处理肝癌细胞,发现只有葡萄糖限制联合索拉非尼实验组能够促进肝癌细胞死亡。也只有索拉非尼联合葡萄糖限制才能促进肝癌细胞死亡,而非其他的抗血管药物如乐伐替尼（Lenvatinib）和布立尼布（Brivanib）。且这种死亡方式能被N-Acetyl-L-cysteine（NAC,ROS抑制剂）保护,但不能被ferrostatin-1（铁死亡抑制剂）,Z-VAD-FMK（泛caspase抑制剂）,necrostatin-1（凋亡性坏死抑制剂）保护。（2）索拉非尼联合葡萄糖限制引起线粒体的损伤,导致线粒体膜电位下降,ATP的产生受到明显抑制,相应的线粒体耗氧率下降,大量ROS的产生。（3）索拉非尼单独处理能够促进磷酸化的泛素化蛋白的增加和众多线粒体内外膜蛋白的表达降低（具有时间和剂量依赖性）,并促进线粒体DNA含量的降低和m Keima的红色荧光增强。这提示了索拉非尼单独处理诱导了线粒体自噬。但是索拉非尼联合葡萄糖限制后所有的变化都被抑制,即与单独索拉非尼组相比磷酸化的泛素化蛋白减少,线粒体内外膜蛋白表达增加,线粒体DNA含量增多和m Keima的红色荧光减少。沉默线粒体自噬重要基因PINK1后与未对PINK1沉默的细胞相比,在联合索拉非尼处理后,磷酸化的泛素化蛋白减少,线粒体内外膜蛋白表达增加,细胞死亡情况更严重。（4）卡格列净是一种目前已应用于临床的降糖药,主要通过抑制葡萄糖转运蛋白SGLT2达到降糖效果。与葡萄糖限制的培养液处理相同,卡格列净联合索拉非尼也可以促进肝癌细胞死亡。两种药物联合能够抑制单独索拉非尼对线粒体自噬变化（即磷酸化的泛素化蛋白增加,线粒体内外膜蛋白的表达降低和m Keima的红色荧光强度增强）。（5）裸鼠移植瘤实验的结果显示索拉非尼联合卡格列净抑制肝癌移植瘤的生长。索拉非尼联合卡格列净组的TUNEL染色的阳性细胞比例明显多于另外三组,HE染色显示组织结构破坏呈淡染区面积占总面积的比例大于各单独处理组,而Ki-67免疫组化染色的情况是索拉非尼联合卡格列净组弱于各自单独处理组。结论（1）索拉非尼联合葡萄糖限制明显促进肝癌细胞死亡,且这种死亡既不是铁死亡,也不是凋亡或者是坏死性凋亡,但与ROS的生成有关。（2）索拉非尼能靶向损伤线粒体,导致线粒体膜电位下降,产生ROS同时降低ATP产生。同时索拉非尼诱导了线粒体自噬的发生,后者是一种保护性机制来限制线粒体的过度损伤。而索拉非尼联合葡萄糖限制却通过抑制PINK1的活性,从而抑制了线粒体自噬的过程,导致更为严重的线粒体损伤,ATP含量大幅下降,大量ROS的产生,最终导致细胞死亡。（3）卡格列净联合索拉非尼同样能促进肝癌细胞的死亡,且索拉非尼和卡格列净的联合组同样能够抑制索拉非尼单独诱导的线粒体自噬过程。同时,卡格列净联合索拉非尼能抑制小鼠肝癌移植瘤的生长,抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞的死亡。