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近年来,HIV感染在全球呈迅猛上升趋势,现已成为危害人类健康最严重的传染病之一。现有的抗病毒药物都不能根治艾滋病,为降低感染者的发病率以避免更多的人感染HIV病毒,研制有效的HIV疫苗成为HIV防治的重要手段之一。HIV分为1型和2型,其中HIV-1目前流行最为广泛。Tat蛋白是人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)RNA转录的反式激活因子,是病毒产生的重要调控蛋白和致病因子,在HIV-1的复制、扩散和致病中起重要作用。完整的Tat蛋白含有6个功能区:N端区(1-21aa)、半胱氨酸富集区(22-37aa)、核心区(38-48aa)、碱性氨基酸富集区(49-59aa)、谷氨酰胺富集区(60-72aa)以及C端区(73-102aa)。在HIV-1感染者中,Tat抗体的出现与艾滋病的发病呈明显的负相关,可使HIV-1血清阳性感染者长期不发病。Tat蛋白所诱导的中和抗体能在体外试验和动物体内抑制病毒的复制和疾病的产生。在HIV Tat疫苗的研究上,本实验室已构建的缺失半胱氨酸富集区的PET32a-Tat(△C)蛋白明显提高了Tat蛋白的原核表达水平和分子稳定性,同时较好地保留了其免疫原性,但是免疫小鼠后产生的抗体效价不高,对Tat分子的一级结构进行改造是获得高效新免疫原的有效途径,对制备预防性和治疗性的Tat疫苗的具有重要意义。本研究分以下三部分进行:一.HIV-1型HXB2株Tat半胱氨酸富集区C端移位突变体的构建,原核表达及免疫原性分析Tat蛋白的C端区是产生细胞免疫的重要抗原表位,半胱氨酸富集区有7个保守的半胱氨酸(C22、C25、C27、C30、C31、C34和C37),具有多种细胞外作用,还具有免疫自佐剂功能,用PCR拼接的方法将HIV-1 HXB2株Tat基因的半胱氨酸富集区(64-111位核苷酸,22-37位氨基酸)移位至Tat基因的3′末端,获得其突变体序列(Tat-cct DNA),并构建其原核表达质粒pET32a-Tat-cct,并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达出相对分子量为31 000的蛋白,并用Ni-NTA亲和层析法纯化表达蛋白,纯化后目的蛋白浓度为3.46g/L。pET32a-Tat-cct蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体滴度为1:1 600,该抗体与Tat-cct蛋白和Tat蛋白(1-101 aa)均呈特异性结合二.HIV-1型HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体的构建,原核表达和免疫原性分析Tat蛋白的N端区是产生细胞免疫的重要抗原表位,应用PCR的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区(64-111位核苷酸,22-37位氨基酸)移位至缺失半胱氨酸富集区的Tat(△C)的N末端,获得其突变体序列(Tat(CN) DNA),构建其原核表达质粒pET32a-Tat(CN),并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达出相对分子量为31000的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析法纯化其浓度为5.17 g/L,经SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物,纯化后的产物用间接ELISA和Western-blot进行鉴定。间接的ELISA和Western-blot结果表明, pET32a-Tat(CN)能与Tat兔抗血清呈特异反应。三.HIV-1型HXB2株蛋白酶的重组蛋白的构建及其在大肠杆菌中的表达HIV Tat的半胱氨酸富集区具有特殊的结构和免疫自佐剂功能,人类免疫缺陷病毒蛋白酶PR,在HIV生命周期中具有极其重要的作用, PR是HIV复制所必需的酶,应用PCR拼接的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区(64-111位核苷酸,22-37位氨基酸)移位至HIV蛋白酶PR的C末端,获得其突变体序列(PR(CC) DNA),构建其原核表达质粒pET32a-PR(CC),并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,经SDS-PAGE电泳显示纯化后pET32a-PR(CC)融合蛋白(4.32 g/l)的相对分子质量约为31600,为HIV-1 Tat疫苗的研究提供了一种可能的新型免疫原。本研究从横向和纵向对HIV-1 Tat的半胱氨酸富集区进行研究,成功构建及表达半胱氨酸富集区的Tat蛋白的C端区和N端区的移位突变体,并保留了免疫原性,为进一步研究高效价的抗体打下了基础;成功构建了PR融合蛋白的原核表达质粒pET32a-PR(CC),为Tat蛋白结构和功能的进一步研究提供了新的模式,为开发HIV Tat疫苗提供一种新型免疫原。