现代社会的高速发展、日趋激烈的社会竞争、以及快节奏的生活状态使越来越多的人们承受着各种生理、心理上的应激。越来越多的系统性疾病被证实与心理应激、过度的精神压力存在着相关关系。口颌肌是口颌系统的重要组成部分,具有维持下颌稳定、参与咀嚼运动、以及参与下颌发育的重要功能。大量研究结果表明,异常的心理状态与口颌肌的结构功能异常存在着相关关系,包括口颌肌疲劳、疼痛敏感、微结构和功能等一系列变化。本课题组前期研究结果证实,心理应激能够激活脑内控制下颌运动的相关核团,并且兴奋性递质谷氨酸传递增强,使得口颌肌肌紧张度升高,直接或间接导致其病理变化。在口颌肌,尤其是深层咬肌内,含有较多的本体觉感受器肌梭,肌梭的主要功能是感知肌肉的牵拉、张力、运动速率的变化等,并将这些本体觉信息传递至神经中枢而做出反应。研究表明,咬肌肌梭传入神经与脑内颌面部运动相关核团形成复杂的神经联系,是参与口颌肌牵张反射、调节口颌肌运动的重要组成部分。咬肌肌梭传入神经元属于假单极神经元,其细胞体位于脑干部位的三叉神经中脑核(Mesencephalic trigeminal nucleus,Vme),是全身唯一一类胞体位于脑内的初级传入神经元,因此,Vme神经元的兴奋性不仅受到口颌肌的牵张变化所影响,还同时被一系列来自于脑内其他部位的神经终末投射所调节。研究证实,肌梭传入神经元属于谷氨酸能神经元,兴奋性神经递质谷氨酸以及其相关受体在肌梭传入神经传导本体觉信息过程中发挥重要作用。那么,在机体受到心理应激时,咬肌肌梭以及肌梭传入神经元会发生怎样结构与功能的变化,谷氨酸及其受体又在其中发挥了怎样的作用,目前尚未见相关研究报道。本研究建立大鼠慢性束缚应激模型,采用行为学实验、ELISA技术、组织病理染色、全细胞膜片钳技术、免疫组织荧光染色、以及透射电镜等方法,探究了大鼠在慢性心理应激状态下咬肌肌梭以及肌梭传入神经的一系列变化,并从谷氨酸受体之一N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptors,NMDARs)出发,采用NMDARs抑制剂MK801对其进行拮抗,探讨神经递质谷氨酸及其受体在这一过程中的作用机制。本研究分为两部分实验,具体如下:第一部分:心理应激对大鼠咬肌肌梭形态学及肌梭传入神经元兴奋性影响的研究实验一大鼠心理应激模型的建立与评价我们将大鼠采用随机方法分为四组:对照组,心理应激组,低剂量MK801组(0.1mg/kg),高剂量MK801组(0.2mg/kg)。应激组大鼠给予6 h/day的束缚应激,持续14天,建立大鼠慢性心理应激模型。药物组大鼠通过腹腔注射药物,两天一次。我们通过体重测定、行为学检测以及血清学检测验证动物模型,结果显示,心理应激组大鼠的体重增长速度明显减慢;大鼠在旷场中的中央活动距离、总活动路程、移动速率明显降低;高架十字迷宫中大鼠进入开臂的时间与次数、以及活动总路程明显降低;血清皮质酮(Corticosterone,CORT)与促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH)水平明显升高。而MK801能够剂量依赖性的减轻动物的应激样行为学、血清学变化。本部分实验结果证实了慢性束缚应激能够造成大鼠处于心理应激状态,保证了后续实验的进行。实验二心理应激对大鼠咬肌肌梭形态学影响的研究在本实验中,我们通过对深层咬肌进行组织学切片并进行HE染色,结果发现,心理应激以及MK801治疗对大鼠深层咬肌的组织学结构没有明显的影响作用;并且,心理应激或MK801治疗对咬肌肌梭的数目、梭内肌纤维数量、直径以及肌梭囊壁厚度没有明显的影响。以上结果说明,心理应激对大鼠咬肌肌梭在光镜水平下的结构没有影响作用。实验三心理应激对大鼠咬肌肌梭传入神经元兴奋性影响的研究在本实验中,我们通过全细胞膜片钳技术,观察心理应激对咬肌肌梭传入神经元电生理特性的影响。结果发现,心理应激能够明显降低肌梭传入神经元的静息膜电位(Resting membrane potential,RMP),升高动作电位(Action potential,AP)发放幅度,延长AP发放时间,降低后超极化电位(After hyperpolarization,AHP)幅度,并且增加了一定刺激电流下神经元的AP发放频率。同时,心理应激还明显增加了肌梭传入神经元自发性兴奋性突触后电流(Spontaneous excitatory postsynaptic current,s EPSC)的频率与幅度。MK801能够剂量依赖性拮抗心理应激带来的上述变化。实验结果说明,心理应激能够明显提高肌梭传入神经元的神经兴奋性。而MK801治疗能够一定程度上减轻心理应激对神经元兴奋性的增强作用。第二部分:心理应激对大鼠咬肌肌梭及肌梭传入神经元影响的机制研究实验一心理应激对大鼠咬肌肌梭及肌梭传入神经元谷氨酸相关物质表达影响的研究在本部分实验中,我们通过免疫组织荧光染色技术,从谷氨酸及其受体出发,观察心理应激对大鼠咬肌肌梭传入神经元相关物质表达的影响。结果发现,心理应激能够增加咬肌肌梭传入神经元外周末梢(肌梭环螺形末梢)与中枢末梢也就是三叉神经运动核(Trigeminal motor nucleus,Vmo)的囊泡膜谷氨酸转运体1(Vesicular glutamate transporter of type 1,VGLUT1)的表达,同时增加了神经元胞体的谷氨酰胺酶2(Glutaminase 2,GLS2)的含量。其次,心理应激能够明显增加Vme内神经终末的VGLUT1表达量,并且增加了肌梭传入神经元内NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B的表达量。MK801治疗对于心理应激造成的VGLUT1阳性终末、以及GLS2的表达升高没有抑制作用,而对心理应激造成的NMDARs表达有明显的抑制作用。实验结果表明,心理应激导致了肌梭传入神经元谷氨酸合成与转运的增加,同时其受到的谷氨酸能突触传递也增加,两者共同作用,导致了Vme神经元兴奋性的增强。实验二心理应激对大鼠咬肌肌梭传入神经元突触结构影响的研究在本部分实验中,我们采用透射电镜技术,观察了心理应激对Vme部位神经元超微结构的影响作用。结果发现,心理应激能够明显增加Vme内与神经元胞体形成的兴奋性突触的数量、突触前终末内线粒体的数量、以及突触后致密区(Post synaptic density,PSD)的长度与厚度,而心理应激对抑制性突触的数量以及PSD没有明显影响作用。并且MK801治疗能够明显降低心理应激导致的兴奋性突触PSD的长度与厚度的增加,但对兴奋性突触以及突触前终末内线粒体的数量增加没有明显的抑制作用。实验结果说明,心理应激通过增加对Vme神经元的兴奋性神经终末投射作用而增强了肌梭传入神经元的兴奋性。研究结论:束缚应激模型造成的心理应激状态能够明显增强大鼠咬肌肌梭传入神经元的兴奋性,其结果导致了咬肌本体觉传入冲动增强。而谷氨酸作为肌梭传入神经元传递信息的主要兴奋性递质,其在神经元胞体内的合成与其向神经终末的转运都出现了明显的增多。同时,心理应激还增加了肌梭传入神经元胞体所在部位Vme的谷氨酸能投射,以及NMDARs的表达,并从超微结构的角度证实了心理应激确实增加了与Vme神经元形成突触的数量以及PSD的长度与厚度。另一方面,NMDARs拮抗剂MK801通过抑制Vme内NMDARs的表达量,以及在超微结构下减少PSD的长度与厚度,达到减轻心理应激导致肌梭传入神经元兴奋增强的作用。因此,本研究结果为进一步系统深入的研究心理应激对口颌肌的影响作用、心因性因素致口颌系统疾患的发病机理及其防治措施提供理论基础。本课题的创新点:1.通过建立动物模型,首次探究了心理应激对咬肌肌梭形态学与电生理学特性的影响作用。2.首次从神经递质谷氨酸及其受体的角度出发,探讨了其在心理应激致咬肌肌梭传入神经元兴奋性升高过程中的作用机制。3.首次从细胞超微结构变化出发,阐明了Vme神经元胞体接受的兴奋性突触变化在心理应激致肌梭传入神经元兴奋性变化中的作用。