肾细胞癌(renal cell careinoma,RCC)是泌尿系统的常见肿瘤,占全部成人肿瘤发病率的2％～3％,居泌尿生殖系癌的第2位,其发病率呈上升趋势,并且发病率以大约每年2％的速度递增。肾癌占所有肾肿瘤大约60％～70％,其中肾透明细胞癌约占肾癌的75％。随着影像学技术应用的R渐普及,早期诊断肾癌所占比例人数逐渐增加,根治性肾癌切除术(radical nephrectomy,RN)是目前治疗局限性肾细胞癌最有效的方法,但仍有约30％的患者术后易发生复发、转移,由于缺乏早期诊断及对晚期患者的有效治疗,此类患者仍保持着较高的死亡率。40％的肾细胞癌患者确诊时已处于局部进展期或发生转移。对于晚期肾细胞癌患者(Ⅳ期)5年生存率仅为5％-10％。目前临床上对于晚期和转移性肾细胞癌患者主要进行免疫治疗,包括白介素2(interleukin2,IL-2)和干扰素(interferon,IFN)的单独或联合治疗。但临床缓解率不高。近年应用多靶点酪氨酸激酶抑制剂如索拉非尼(Sorafenib)和舒尼替尼(Sunitinib)治疗晚期或转移性肾癌取得初步成功,但长期疗效尚不能确定,且价格昂贵。因此了解肾细胞癌发生和进展的分子机制对于提高患者早期诊断和早期治疗十分重要。最近关于肾癌研究方面,分子诊断方面生长因子成为研究热点。　　 胰岛素样生长因子家族(insulin like growth factors,IGFs)是一类具有促进细胞增殖、分化以及血管形成等多种生物活性的多肽生长因子,IGF-1及其IGF—1R是该家族重要成员,两者的异常激活与多种肿瘤的发生、发展关系密切。流行病学研究显示,在循环中高水平的.IGF—1同上皮癌的风险增加有关。Takahashi M等发现IGF轴的失衡同肾透明细胞癌发生有关。Rosendahl AH等应用SCID小鼠建立人肾癌Caki-2肿瘤模型中发现用重组人IGF-1在早期,提高了肿瘤2—4倍的生长,并且提高了IGFBP-3和pSmad2的水平。Parker AS等通过对263例肾透明细胞癌进行免疫组化和随访发现,IGF-1R染色阳性的病人相对于IGF-1R阴性的病人死亡率增高3倍。Rasmuson T等通过对256例肾细胞癌研究发现,血清IGF-1(浓度的中位数为55ng/ml)同患者的预后有关,同肿瘤的分期和分级无关。Sichani删等对82位行根治性肾切除术病人免疫组化分析,IGF-1R评分≤4分的病人生存中位数为90.21月,IGF-1R评分>4分的病人生存中位数为33.39月；统计分析表明IGF-1R同肾癌的预后和Fuhrman分级有关。有研究表明,通过抗IG-1R单克隆抗体、IGF-1类似物或反义RNA等方法阻断IGF-1R信号传导通路的某个环节,可以起到抑制肿瘤细胞生长、促进凋亡的作用;IGF-1R单克隆抗体在肺癌和胰腺癌的动物模型研究中,均被证实能抑制肿瘤的生长,但有关抑制率、转染率、稳定性、安全性、特异性及有效靶序列的筛选等问题,仍然限制着这些技术的进一步应用。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术的出现为快速、准确的研究基因的功能,寻找基因治疗的靶点带来了希望,同时治疗性的基因沉默技术作为一种基因治疗的手段也拥有巨大的潜力。　　 本课题首先应用实时荧光定量PCR法(real-time fluorescent quantitativepolymerase chain reaction,rqPCR)检测43例肾细胞癌组织中IGF-1、IGF-1R和胰岛素受体底物1、2、5、6的表达水平和免疫组织化学方法检测肾透明细胞癌组织中IGF-1R癌组织蛋白的表达情况,初步探讨IGF-1、IGF-1R和胰岛素受体底物(insulin receptor subtrate,IRS)1、2、5、6可能与肾细胞癌的发生、发展的可能关系,并分析其与临床病理指标的关系。接下来将构建的经化学修饰的小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)转染到肾癌786-O细胞中,明确IGF-1R-siRNA在基因和蛋白水平能够有效抑制IGF-1R的表达。并研究干扰IGF-1R基因后对细胞生长、细胞凋亡和对bcl-2蛋白表达的影响。本课题采用RNA干扰方法研究IGF—1R基因对肾癌786-O细胞增殖的影响,为肾癌的基因治疗提供了一定的实验依据。　　 第一部分 IGF-1和IGF-1R在肾癌组织中的表达及临床意义　　 目的:本研究检测IGF-1及其受体IGF-1R在肾透明细胞癌组织和对应癌旁正常组织中的表达,评价IGF-1和IGF-1R的临床意义。　　 方法:应用免疫组织化学SP法检测43例ccRCC组织和癌旁正常肾组织中IGF-1R蛋白的表达,应用实时荧光定量PCR法对IGF-1及IGF-1R基因在肾透明细胞癌组织和对应癌旁正常组织中的表达进行检测,并分析其与临床病理指标的关系。　　 结果:IGF-1基因在肾透明细胞癌组织中的相对表达量为(21.58±4.38),对应癌旁正常组织中IGF—1基因的相对表达量为(12.43±3.27),组间差别比较有统计学意义(P<0.05)；IGF-1R基因在肾透明细胞癌组织中的相对表达量分别为(22.73±4.14),对应癌旁正常组织中IGF-1基因的相对表达量分别为(11.32±4.64),组间差别比较有统计学意义(P<0.05)。43例肾透明细胞癌组织中有36例表达IGF-1R蛋白,表达率为81.40％(35/43)；43例癌旁正常肾组织有10例表达IGF—1R蛋白,表达率为23.26％(10/43),肾透明细胞癌组织IGF-1R蛋白表达水平显著高于癌旁正常肾组织,组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。IGF—1基因、IGF-1R基因和蛋白表达与肿瘤临床分期有关(P<0.05),与患者性别、年龄、肿瘤大小及病理分级无关(P>0.05)。　　 结论:IGF-1和IGF-1R基因在肾透明细胞癌组织和对应癌旁正常组织中存在着普遍的表达,而在肾透明细胞癌组织中存在着较高的表达强度,并且IGF-1R蛋白在肾透明细胞癌组织中存在过量表达,提示IGF-1和IGF-1R在肾透明细胞癌细胞癌变过程中可能发挥重要作用。　　 第二部分实时荧光定量PCR检测肾透明细胞癌hIRS-1、hIRS-2、hIRS-5和hIRS-6 mRNA的表达及临床意义　　 目的:本研究检测hIRS-1 mRNA、hIRS-2 mRNA、hIRS-5 mRNA和hIRs-6mRNA在肾透明细胞癌组织和对应癌旁正常组织中的表达,并分析其与临床病理参数之间的关系,评价hIRS-1、hIRS-2、hIRS-5和hIRS-6的临床意义。　　 方法:应用实时荧光定量PCR法对hIRS-1、hIRS-2、hIRS-5和hIRS-6基因在肾透明细胞癌组织和对应癌旁正常组织中的表达进行检测,并分析其与临床病理指标的关系。　　 结果:hIRS-1 mRNA在肾透明细胞癌中存在低表达,hIRS-1基因在肾透明细胞癌组织和对应癌旁正常组织中无显著差异(14.37±4.57 vs16.54±4.81,P>0.05),hIRS-2在肾透明细胞癌中存在高表达,hIRS-2基因在肾透明细胞癌组织和对应癌旁正常组织中有显著差异(22.71±5.01 vs16.11±5.28,P<0.05)；hIRS-5 mRNA在肾透明细胞癌中存在较高表达,hIRS-5基因在肾透明细胞癌组织和对应癌旁正常组织中有显著差异(24.92±5.25 vs16.30±5.29,P<0.001),hIRS-6在肾透明细胞癌中和对应癌旁正常组织中存在表达,其相对表达量分别为(20.58±4.81vs15.79±4.63,P>0.05)。hIRS-2 mRNA的表达与肿瘤大小及临床分期有关(P<0.05),与患者年龄、性别、及病理分级无关(P>0.05),hIRS-1mRNA的表达与患者年龄、性别、病理分级、肿瘤大小及临床分期无关(P>0.05)；hIRS-5 mRNA、hlRS-6 mRNA的表达与肿瘤临床分期有关(P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤大小及病理分级无关(P>0.05)。　　 结论:hIRS-1在肾透明细胞癌中存在低表达,提示hIRS-1基因在肾透明细胞癌细胞癌变早期可能发挥一些作用；hIRS-2基因和hIRS-5基因在肾透明细胞癌中存在高表达,提示MRS-2基因和hIRS-5基因在肾透明细胞癌细胞癌变过程中可能发挥重要作用,hIRS-6基因在肾透明细胞癌细胞癌变过程中可能不起重要作用。　　 第三部分小干扰RNA沉默IGF-1R基因表达对肾癌786-O细胞体外生长的影响　　 目的:评价RNA干扰(RNAi interference,RNAi)技术对肾癌786-O细胞系中胰岛素样生长因子1类受体(IGF-1R)表达的阻断效应,以及IGF-1R基因沉默后细胞凋亡相关基因和肿瘤体外生长生物学特性的改变。　　 方法:根据IGF-1R基因序列特点,设计并用化学方法合成小干扰核糖核酸分子(small interfering RNA,siRNA),转染肾癌786-O细胞后,分别采用RT-PCR和Western Blot检测IGF-1R基因mRNA和蛋白表达水平。分别采用MTT法和Annexin V/PI流式细胞分析法检测786-O细胞检测体外培养细胞的生长增值率和细胞凋亡百分率变化。　　 结果:所设计的3组siRNA中第1组和第2组均能抑制肾癌786-O细胞IGF-1R mRNA水平,以第2组效果最好,且呈浓度和时间依赖性。第2组IGF-1R蛋白表达水平明显下降,并同步伴随bcl-2表达减少,肿瘤细胞凋亡率增加和细胞生长活力明显下降。　　 结论:运用RNAi技术能有效抑制786-O细胞IGF-1R的表达,使细胞增殖能力减弱,凋亡易感性增加。RNAi介导IGF-1R基因沉默有可能成为肾透明细胞癌的基因治疗提供新的靶点和思路。