【摘 要】
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生物毒素是生物体产生的有毒物质,根据来源不同可分为动物毒素、植物毒素和微生物毒素。其中,植物毒素α-鹅膏毒肽和微生物毒素赭曲霉毒素(OTA)化学性质稳定、毒性较强,是生物毒素中重点关注对象。α-鹅膏毒肽是鹅膏菌中毒事件中的主要致死毒素,人的致死剂量约为0.1 mg/kg。OTA被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)确定
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生物毒素是生物体产生的有毒物质,根据来源不同可分为动物毒素、植物毒素和微生物毒素。其中,植物毒素α-鹅膏毒肽和微生物毒素赭曲霉毒素(OTA)化学性质稳定、毒性较强,是生物毒素中重点关注对象。α-鹅膏毒肽是鹅膏菌中毒事件中的主要致死毒素,人的致死剂量约为0.1 mg/kg。OTA被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)确定为2B类致癌物,主要作用于人类和动物的肝脏和肾脏。目前,α-鹅膏毒肽和OTA常用的检测技术包括高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、液相色谱质谱法(Liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)、酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和侧流免疫层析法(Lateral flow immunoassay,LFIA)等。现有的检测技术大多是基于抗原-抗体之间的特异性识别,本论文中引入新的识别因子——核酸适配体,建立了一系列α-鹅膏毒肽和OTA的检测方法。首先,在传统ELISA方法的基础上进行改良,利用免疫磁珠固定核酸适配体,建立了α-鹅膏毒肽的免疫磁珠-ELISA法,该方法操作简单、特异性强。检测限为0.1μg/m L,在0.01-6μg/m L范围内线性关系良好,可用于蘑菇样品和尿液的检测。其次,基于胶体金在高盐溶液中的聚集现象,及核酸适配体对胶体金聚集的抑制作用,建立了α-鹅膏毒肽的无标记、无固定的胶体金分光光度法。该方法的检测限为0.312μg/m L,在0.05-2μg/m L范围内线性关系良好,可用于蘑菇样品的检测。再次,为了进一步提高检测的灵敏度,建立了OTA的荧光标记法和荧光碳点法。荧光标记法是基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理,以适配体及互补链(c DNA)为主体,实现了定量检测OTA的目的,该方法的检测限为0.01μg/m L,在0.01-0.25μg/m L浓度范围内线性关系良好,可用于实际样品的检测,回收率在90%-99%之间。荧光碳点法是将制备的荧光碳点与核酸适配体结合,并作为荧光探针用于检测的方法。该方法的检测限可达4 ng/m L,在0.004-1μg/m L浓度范围内线性关系良好,可用于红酒样品的检测,回收率在80%-96%之间。为了研究核酸适配体与靶标之间的结合机制,本论文通过分子对接初步研究了体外环境下α-鹅膏毒肽与核酸适配体的识别位点和结合口袋。α-鹅膏毒肽主要与核酸适配体表面的疏水性沟槽发生相互作用,两者的主要结合碱基为T3,G4,C5,T6,T7,C67和A68。
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