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从2019年底开始,新型冠状病毒肺炎（COVID-19）席卷了两百多个国家,造成五亿多人感染,给全人类造成了重大的生命财产损失,被世界卫生组织（WHO）称为国际关注的突发公共卫生事件（PHEIC）。造成新冠肺炎的病原体是一种RNA病毒,被命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。RNA 作为 SARS-CoV-2 的遗传物质,建立 SARS-CoV-2 RNA 的高灵敏检测方法,对COVID-19的早期诊断、疫情的防控具有重要意义。N6-甲基腺苷（m6A）是腺苷A第六位N原子被甲基化修饰形成的,是真核生物,尤其是高等真核生物mRNA中最常见、含量最多的一种甲基化修饰方式。m6A的甲基化过程是动态可逆的,腺苷A在甲基转移酶复合物（METTL 3、METTL 14和WTAP）的催化作用下形成m6A,m6A又可以在去甲基化酶（FTO或ALKBH5）的作用下脱去甲基变成腺苷A。研究表明,m6A在基因表达中发挥着重要的调控作用,包括mRNA的翻译、剪接和降解等。除此之外,m6A修饰水平的异常与多种疾病（精神障碍、代谢综合征和心血管疾病）以及多种癌症（急性髓细胞白血病、脑肿瘤和生殖系统相关癌症等）密切相关。因此精确定量分析RNA中的m6A对其生物学功能研究以及相关疾病的诊断具有重要意义。本论文中,我们基于电场驱动的荧光微米马达,建立了一种定量检测SARS-CoV-2RNA的数字化单分子计数方法。同时,通过将对m6A敏感的酶（T3DNA连接酶、Bst DNA聚合酶、VMC10脱氧核酶）与核酸扩增反应或CRISPR/Cas12a系统相结合,我们研究建立了两种具有高灵敏度、高选择性的m6A定量检测方法。（1）我们基于电场驱动的荧光微米马达创建了一种定量检测SARS-CoV-2RNA的数字化单分子计数方法。该方法借助于肽核酸（PNA）探针的高亲和力和高选择性优势,使用PNA功能化的荧光微球来捕获SARS-CoV-2 RNA。通过调控荧光微球的数量,实现一个SARS-CoV-2RNA分子绑定一个荧光微球形成一个微米马达,从而在SARS-CoV-2 RNA与荧光微球之间建立一一对应的关系。在外加电场下,一个SARS-CoV-2 RNA分子可以驱动一个微米马达定向移动到指定区域,实现与背景信号的完全分离。最后通过对微米马达的计数,实现对SARS-CoV-2RNA的数字化定量分析。该方法成功实现了在单分子水平上对SARS-CoV-2RNA进行数字化定量检测,并且可以识别SARS-CoV-2RNA中的单碱基突变。因此,该方法在病毒的追踪和临床诊断方面具有很大潜力。（2）m6A可以阻碍Bst DNA聚合酶的逆转录活性以及T3 DNA连接酶的连接活性。基于这一特征,我们建立了一种基于缺口填充-连接反应的滚环-环介导等温扩增（GLR-LAMP）来定量分析RNA中的m6A。GLR-LAMP通过使用一个特殊设计的锁式探针与靶分子RNA杂交,然后在待测位点留下一个单核苷酸缺口。当待测位点为腺苷A时,锁式探针的3’端会在Bst DNA聚合酶的催化作用下延伸一个碱基U,然后被T3 DNA连接酶连接成环状DNA。当待测位点为m6A时,m6A会阻碍锁式探针3’端的单碱基延伸。由于锁式探针5’端和3’端之间存在缺口,所以不能被T3 DNA连接酶连接成环状DNA。即使m6A对Bst DNA聚合酶的阻碍效率不是100%,仍有少量锁式探针的3’端延伸了一个碱基U,m6A也能在一定程度上阻碍T3 DNA连接酶将锁式探针连接成环,因此环状DNA产物会大大减少。随后,环状DNA会进行滚环扩增和环介导等温扩增反应,在扩增反应过程中使用SYBRGreen Ⅰ作为荧光染料对扩增产物进行实时监测,最后根据扩增产物的减少量便可以计算出该位点m6A修饰的比例。通过使用Bst DNA聚合酶和T3 DNA连接酶对m6A进行双重识别,GLR-LAMP可以清楚地区分A和m6A,选择性高达100倍。除此之外,滚环扩增和环介导等温扩增保证了方法的灵敏度,最低能够检测1 fM的RNA靶分子。该方法成功检测了 HeLa和HEK293T细胞MALAT1 lncRNA 2577th 位点 m6A 修饰的比例。（3）脱氧核酶VMC10可以特异性识别并切割RNA中“GAC”位点的未甲基化的A碱基。基于此,我们建立了一种脱氧核酶介导的CRISPR/Cas12a系统（DCAS）定量检测RNA中的m6A。该方法首先将脱氧核酶VMC10与靶分子RNA在待测“GAC”位点杂交,VMC10可以高效地切割“GAC”位点中未甲基化的A碱基,但不切割m6A。经过酶切反应后,只有待测位点为m6A的RNA可以进行RT-PCR扩增。PCR扩增产物可以作为底物被CRISPR/Cas12a系统识别,然后激活Cas12a的反式切割活性对荧光报告探针进行切割并产生荧光信号。通过监测荧光信号的强度并与参比样本（没有进行VMC10切割处理）进行对比,便可直接得到待测位点m6A修饰的比例。此外,该方法灵敏度高,最低可以检测100 aM含有m6A的RNA靶分子,并且可以监测m6A修饰比例的微小变化。