菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）是我国重要的海水经济养殖贝类，主要依赖非特异性免疫系统进行免疫防御。溶菌酶作为一种重要的免疫效应因子，在机体免疫防御反应中发挥重要作用。溶菌酶具有生物多样性，在动物界中存在C型（chicken type lysozyme，C-type）、G型（goose type lysozyme，G-type）和I型（invertebrate type lysozyme，I-type）三大类型。　　本研究通过实验室已有的EST序列，运用RACE技术，从菲律宾蛤仔体内克隆获得I型溶菌酶（RpiLYZ-2）基因全长cDNA序列。分析结果显示：其cDNA全长为709 bp，开放阅读框（ORF）包括471 bp，编码156个氨基酸，预测分子量为17.78 kDa，理论等电点为8.16，含有信号肽序列，其长度为16个氨基酸；具有完整的失稳酶结构域（Leu25-Tyr150）。荧光定量结果分析表明，该基因在外套膜组织中表达量最高，在肌肉组织中表达量最低。对 RpiLYZ-1（本实验室克隆获得）和 RpiLYZ-2进行了同源性分析和系统发育树构建分析，结果表明：RpiLYZ-1和RpiLYZ-2的同源性较低，相似度只有37％左右；RpiLYZ-1与双壳贝类I型溶菌酶的亲缘关系较近，而RpiLYZ-2与黑腹果蝇的I型溶菌酶亲缘关系较近，说明RpiLYZ-1和RpiLYZ-2属于两种不同亚型的I型溶菌酶。　　本研究运用单因素实验，探讨了环境因子改变对菲律宾蛤仔两种I亚型溶菌酶基因表达的影响。分别在温度（13℃、21℃、29℃）和盐度（12、22、32）下刺激菲律宾蛤仔7 d，运用实时荧光定量技术检测RpiLYZ-1和RpiLYZ-2基因表达量的变化情况。结果表明：在不同温度和盐度刺激下，RpiLYZ-1基因的表达量变化趋势大体为先上升后下降，RpiLYZ-2基因的表达量变化趋势大体为先下降后上升，但高温和低盐刺激均能影响菲律宾蛤仔溶菌酶基因的表达。鳗弧菌刺激菲律宾蛤仔72 h，RpiLYZ-1基因表达变化趋势为先上升后下降再上升，RpiLYZ-2基因表达变化趋势为先下降后上升。根据RpiLYZ-1和RpiLYZ-2基因表达变化趋势推测两种亚型溶菌酶可能存在功能分化。　　在体外构建重组蛋白表达载体 RpiLYZ-1-pEASY-E1和 RpiLYZ-2-pET-21a(+)，然后利用大肠杆菌表达系统，在IPTG诱导作用下大量表达两种重组蛋白。再通过镍琼脂糖凝胶色谱法纯化目的蛋白，利用梯度稀释法复性目的蛋白，为检测重组蛋白的生物学活性提供原料。　　利用比浊法检测 RpiLYZ重组蛋白的相关活性。实验结果显示：重组蛋白RpiLYZ最适pH为3.5和5，重组蛋白RpiLYZ-1最适温度为20℃，而重组蛋白RpiLYZ-2最适温度为10℃。重组蛋白RpiLYZ具有广谱的抗菌性，对真菌、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有一定抑菌能力。以阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、鳗弧菌、藤黄微球菌分别为底物，发现重组蛋白RpiLYZ-1和RpiLYZ-2对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有溶菌活性。以肽聚糖为反应底物测定重组蛋白RpiLYZ-1和RpiLYZ-2的胞壁酸酶活性，发现重组蛋白RpiLYZ能够水解细菌的细胞壁。热处理重组蛋白RpiLYZ-1和RpiLYZ-2对溶壁微球菌不具有非酶抑菌活性，但对鳗弧菌和阴沟肠杆菌具有非酶抑菌活性。　　菲律宾蛤仔血细胞具有吞噬作用，能够吞噬藤黄微球菌和灿烂弧菌。加入重组蛋白RpiLYZ-1（浓度约4μM）后，血细胞对藤黄微球菌和灿烂弧菌的吞噬能力分别增加了20%和8%；加入重组蛋白RpiLYZ-2（浓度约4μM）后，血细胞对藤黄微球菌和灿烂弧菌的吞噬能力分别增加了14%和9%，说明重组蛋白RpiLYZs能够在体外促进血细胞的吞噬活性，具有免疫调理功能。　　综上所述，从菲律宾蛤仔中克隆获得不同亚型的I型溶菌酶在其免疫防御上发挥重要作用。当环境因子发生变化时，菲律宾蛤仔会调节体内I型溶菌酶的表达量来进行免疫防御。生物学活性研究结果显示，重组蛋白 RpiLYZ-1和RpiLYZ-2具有广谱抗菌和免疫调理功能。本研究为了解菲律宾蛤仔溶菌酶的免疫作用机制，探讨贝类病原菌抗性提供了基础。